Метод флуоресцирующих антител

Метод флуоресценции (ИФ) или флуоресцирующих (люминесцирующих) антител имеет значительное развитие и применяется для ускоренного выявления, реже идентификации, чистых культур возбудителей многих инфекционных заболеваний. Однако следует подчеркнуть, что метод ИФ оказывается во много раз надежнее при выявлении бактерий с большей антигенной обособленностью.

Сущность метода заключается в том, что но известному антителу, меченному флуорохромом (изоцианат флуоресцеина, радомин и др.), определяют неизвестный антиген. В этом случае реакция антиген — антитело ограничена первой фазой (специфической), без второй — коагуляции комплексов, что имеет известные преимущества перед другими серореакциями.

Одним из условий успешного применения метода иммунофлуоресценции является получение антител высокой специфичности (аффинности). Этому могут способствовать различные способы обработки иммунных сывороток до их метки флуорохромом. Широко используют специфическую микробную адсорбцию, аффинную хроматографию. Значительной специфичности сывороток достигают их фракционированием химическими веществами: сульфатом аммония, солями легких металлов; в последние годы риванолем. Однако более эффективным методом фракционирования признана ионообменная хроматография с использованием ДЭАЭ-целлюлоз, ионообменных сефадексов и ионообменников на основе отечественных гелей ЭД [Аксенова М. П., 1975; Голшмид В. К., 1975; Cherry W., 1974]. Возможны успешные сочетания методов, например микробной адсорбции с ионообменной хроматографией [Голдшмид В. К., Ландсман Н. М., 1979].

Серологическая специфичность сыворотки в основном связана с фракцией IgG. Дальнейшая обработка этой фракции протеолитическими ферментами дает возможность получать еще более высоко специфические фракции, такие, как Fab-фрагмен-ы. Меченные флуорохромом Fab-фрагменты иммуноглобулина не вызывают, кроме того, неспецифической флуоресценции гетероструктурных биологических объектов. Это свойство имеет практическое значение, делая излишним применение контрастирования [Барбан П. С., 1980; Барбан П. С., Пантюхина А. Н., 1984; Storch W., 1979]. Предложен и иной подход к получению антител высокой специфичности, а именно: иммунизация животных синтезированными антигенами. Последние представляют собой антигенные детерминанты S-специфических цепей липо-полисахарида О-антигенов, связываемых далее с бычьим альбумином. Такие сыворотки были приготовлены для идентификации сальмонелл серогрупп В и D. При использовании этих сывороток специфичность их была подтверждена в 99% случаев [Strange R., 1977].

Методом иммунофлуоресценции можно обнаружить энтеробактерии в крови, фекалиях, рвотных массах и другом материале от больных или из объектов окружающей среды. Преимуще­ствами метода являются относительная быстрота выполнения, высокая чувствительность и достаточная специфичность. ИФ позволяет выявлять бактерии возбудителя в материалах, содержащих любое число сопутствующих микробов, если они не имеют выраженного антигенного родства с искомым этиологическим агентом.

Препараты для исследования готовят либо прямым нанесением материала на предметное стекло (если предполагается массивное обсеменение), либо с его предварительным подращиванием на соответствующих питательных средах (в жидких средах накопления или на плотных селективно-дифференциальных). При прямом исследовании делают тонкий мазок из жидкого материала или из осадка суспензии, сделанной из более плотных образцов (оформленного стула, пищевых продуктов и др.). При подращивании посевы в жидких средах выдерживают при 37 °С в течение 16—18 ч, а на плотных—4 ч. После.этого готовят мазки и отпечатки. Лучшие результаты получают при сочетании исследования прямых мазков и препаратов после подращивания.

Для просмотра мазков используют люминесцентные микроскопы, в том числе МЛД-1, предназначенный для работы в полевых условиях. Для создания флуоресценции применяют специальные осветители и светофильтры.

Существуют прямой и непрямой методы иммунофлуоресценции. При прямом методе происходит непосредственная реакция антигена с соответствующими флуоресцирующими антителами, результаты которой учитывают с помощью люминесцентной микроскопии. Для этого метода мазки исследуемого материала подсушивают на воздухе, а затем фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки или 96° спиртом, можно смесью Никифорова. Фиксированные препараты помешают во влажную камеру (чашки Петри, кюветы, эксикаторы с увлажненной ватой или фильтровальной бумагой), наносят на них по капле люминесцирующей сыворотки (в рабочем разведении), через. 15-20 мин промывают и просушивают на воздухе. При работе с малоизученным оборудованием может понадобиться уточнение рабочего разведения. Для этой цели окрашивают заведомо известный штамм люминесцентной сывороткой, взятой в нескольких разведениях. То максимальное разведение, которое обеспечивает яркое специфическое свечение бактерий, является красящим титром. В качестве рабочего разведения принимают удвоенный красящий титр. Мазки исследуют в темной комнате, применяя нефлуоресцирующее иммерсионное масло или химически чистый диметилфталат. Результаты считают достоверными после просмотра 25—30 полей зрения. Свечение окрашенных люминесцирующей сывороткой бактерий считают специфическим при наличии яркого свечения только периферии клетки (тело клетки не светится). Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестную систему.

Сущность непрямого метода заключается в том, что реакция проходит в два этапа: соединение антигена с соответствующей немеченной диагностической сывороткой и затем присоединение к этой смеси видоспецифического флуоресцирующего глобулина. Непрямой метод чаще применяют для определения неизвестных антигенов, имея возможность использовать более широкий набор диагностических препаратов, обычных немеченых агглютинирующих моноспецифических сывороток, соответ­ствующих видовой специфичности меченого глобулина.

Для непрямого метода на препараты, содержащие антиген, наносят каплю диагностической немеченой сыворотки и оставляют при комнатной температуре, во влажной камере на 20 мин, затем тщательно промывают 0,15 М раствором натрия хлорида (рН 7,2—7,4) для удаления несвязавшихся антител и подсушивают на воздухе. После этого на 10—20 мин каплями наносят на мазки люминесцирующую антивидовую сыворотку против глобулинов того вида животного, от которого была получена примененная агглютинирующая сыворотка (например, кролика). Мазки затем промывают, подсушивают и просматривают, как уже было указано. Для непрямого метода, помимо обычных контролей, обязателен контроль изучаемого антигена, обработанного антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой.

При ИФ прямая микроскопия мазка из нативного материа­ла от больных при высокой концентрации возбудителя (500 000 — 1 000 000 клеток в 1 г) позволяет дать положительный или ориентировочный ответ через 45—60 мин. При незначительной концентрации возбудителя (тысячи — десятки тысяч клеток) для получения должного эффекта необходимо применить метод накопления. Соответственно результаты могут быть получены через 5 и 20 ч.

На основе иммунофлуоресцентного метода В. М. Никитиным и Г. П. Постолаки (1976) предложен новый метод — реакция целлюлозофлуоресцирующих антитет (РЦФА). Меченные флуоpoxpoмом антитела насаждают на нитроцеллюлозу, окрашенную бриллиантовым зеленым. Полученные комплексы смешивают на стекло с испытуемым материалом. Результаты учитывают визуально через 2—3 мин или, при отрицательной реакции, через 20—30 мин, иногда больше после выдерживания в термостате (во влажной камере). При положительной реакции на фоне тусклой оранжево-кирпичной флуоресценции частиц целлюлозы наблюдают очень ярко светящиеся края микробных клеток (специфическая реакция + + + +). При этом методе наблюдается феномен гашения фоновой неспецифической флуоресценции. Метод РЦФА испытан с положительными результа­тами на материале, содержащем шигеллы, эшерихии и сальмонеллы.

В нашей стране выпускают коммерческие сухие люминесцирующие сыворотки к антигенам некоторых шигелл, сальмонелл и эшерихии для прямого метода ИФ, а также сухие люминесцирующие антивидовые сыворотки против иммуноглобулинов ряда животных. Подробные указания для их использования имеются в наставлениях по применению.

Иммунофлуоресцентный метод, как и другие ускоренные методы выявления и идентификации возбудителей из числа энтеробактерий, может в основном рассматриваться, как ориентировочный метод, особенно при исследовании фекалий, где безусловно могут присутствовать антигенно-родственные бактерии.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА)

Одним из современных методов серологической идентификации и выявления микроорганизмов и их антигенов может служить реакция коагглютинации [Kronvall G. ct. al., 1970; Kronvall G., 1973]. В эту реакцию, помимо обычных агглютинирующих реагентов (антитела и антигены), введен еще один — белок A. Staphylococcus aureus (штамм Cowan I). Этот белок расположен на поверхности клеточной стенки и обладает спо­собностью выборочно реагировать с Fc-фрагментом иммуноглобулина G человека, кролика и ряда других млекопитающих. Связывая лишь Fc-фрагмент, протеин А оставляет свободными Fab-фрагменты антител IgG, которые могут реагировать с гомогенными антигенами. Кроме того, одновременно с Fc-фрагмен­том из сыворотки удаляются и IgM-антитела, обычно реагирующие с гетерологичными антигенами и обусловливающие перекрестные реакции.

Таким образом, диагностическая сыворотка, обработанная •специально подготовленной взвесью S. aureus штамма Cowan I, становится высокоспецифичной и в ряде случаев не нуждается во фракционировании или микробной адсорбции [Хазен-сон С. Л., 1983].

КОА была предложена для серологического типирования пневмококков. В дальнейшем установлено, что с ее помощью могут быть обнаружены различные вирусы, растворимые антигены, токсины. В этих случаях специфический иммуноглобулин, посаженный на стафилококковые клетки, следует рассматривать как антительный диагностикум высокой специфичности.

Е. Edwards и R. Hilderbrand (1976) показали возможность выявления шигелл и сальмонелл ускоренным методом, непосредственно коагглютинируя материал колоний в чашках со средой Мак Конки.

В нашей стране испытание КОА для серологической идентификации и обнаружения шигелл, а также разработка соответствующих препаратов были предприняты в Ленинградском НИИЭ им. Пастера. К настоящему времени разработан и выпускается производством лиофилизированный стафилококковый реагент, содержащий белок А. Помимо этого, разработана тех­нология получения коагглютинирующих реагентов к S. dysenteriae, S. boydii и S. sonnei (без предварительной адсорбции) и к S. flexneri, где предварительная адсорбция сывороток все же необходима [Хазексон С. Л. и др., 1982; Хазенсон С. Л., 1983].

С целью серологической идентификации шигелл коагглютинация ставится как обычная реакция агглютинации на стекле. При этом реакция наступает значительно быстрее вследствие более высокого содержания антител в реагенте по сравнению с обычной адсорбированной сывороткой и большей его авидностью, зависящей от благоприятной для соединения антиген — антитело ориентации Fab-фрагментов иммуноглобулина на стафилококковой клетке [Хазенсон С. Л. и др., 1982, 1983].

Показана и принципиальная возможность обнаружения растворимых антигенов шигелл с помощью КОА. Приготовлены в лиофилизированном виде КОА-реагенты и разработана рапид-система для обнаружения антигенов некоторых шигелл и сальмонелл в материале от больных [Белая Ю. А., Белая О. Ф., 1982].

В связи с достаточной специфичностью и несомненной рентабельностью производства реагентов для реакции коагглютинации можно считать этот новый способ перспективным как для серологической идентификации шигелл, так и для выявления их растворимых антигенов.

В дальнейшем не исключено привлечение метода КОА и для работы с другими энтеробактсриями.

Приведенными выше методами не исчерпываются возможности ускорения идентификация выделенных культур или выявления антигенов искомых бактерий в исследуемых материалах.

Так, известны, рекомендации по выявлению антигенов энтеробактерий в испражнениях людей и объектах окружающей среды с применением реакции нейтрализации антител (РНАт). Успехи в развитии различных иммунологических методов в перспективе позволят использовать в лабораториях иммуноферментный, радиоиммунологический методы, иммуноэлектрофорез и другие новейшие методики.

 

Глава 5