РНК і її роль в збереженні і реалізації спадкової інформації.

Хімічний склад РНК. Атипові азотисті підстави РНК. Макромолекулярна організація РНК. Типи РНК і їх біологічні функції.

 

Хімічний склад, атипові азотисті підстави і макромолекулярна організація РНК розглянуті раніше (див. 1.2.2). Рібонуклєїновиє кислоти (РНК), присутні в клітках як про-, так і эукариот, бувають трьох основних типів: інформаційна (матрична, мРНК), транспортна (тРНК) і рибосомная (рРНК). У ядрі кліток эукариот міститься РНК четвертого типу - гетерогенна ядерна РНК (гяРНК). У деяких вірусів РНК служить носієм генетичної інформації. мРНК є копією (транскриптом) відповідної ДНК. Цей транскрипт служить матрицею для синтезу білка. Кожні три послідовні підстави мРНК (звані кодоном) детермінують один амінокислотний залишок. Молекули тРНК переносять специфічні амінокислотні залишки до певної ділянки мРНК в ході синтезу білка. В даний час структура тРНК добре відома. Молекули рРНК зустрічаються в різних формах і утворюють в комплексі з білками рибосому - складну органеллу, в якій відбувається синтез білка.

ТРАНСПОРТНА РНК (тРНК) дізнається відповідний кодон в мРНК і переносить потрібну амінокислоту до полипептидной ланцюга, що росте. Пізнавання кодону в мРНК здійснюється за допомогою трьох послідовних підстав в тРНК, званих антикодоном. Між азотистими підставами кодону і антикодону утворюються уотсон-криковские водневі зв'язки за умови, що полинуклеотидные ланцюги антипараллельны. Амінокислотний залишок може приєднуватися до З'-концу молекули тРНК. Специфічність такої системи перенесення забезпечується тим, що є, принаймні, одна тРНК для кожної амінокислоти. Так, тРНК для Рhе позначається тPHKPhe.

У одній эукариотической клітці більше ста різних молекул мРНК, кожна з яких кодує одну або декілька полипептидных ланцюгів.

Молекули тРНК складаються приблизно з 75 нуклеотидов і починаються з фосфорилированного 5'-конца. Першою підставою зазвичай є гуанин. На З'-конце завжди присутньо три підстави -ССА і кінцева ОН-ГРУППА. У структурі тРНК, окрім звичайних, часто присутні мінорні підстави. Виходячи з максимального числа уотсон-криковских пар підстав при даній нуклеотидной послідовності, структуру молекули тРНК прийнято представляти у вигляді «конюшинового листа».

Ділянки, в яких за допомогою Н-связей утворилися пари підстав, називаються стеблами, а одноцепочечные ділянки — петлями. Все відомі тРНК утворюють «конюшиновий лист» з чотирма стеблами (акцепторним, D, антикодоновым і Т) і трьома петлями (D, антикодоновой і Т). Деякі тРНК мають додаткові петлі і/або стебла (наприклад, вариабельная петливши

 

 

 

Ріс.17. Будова дріжджової тРНК

 

дріжджовий фенилаланиновой тРНК). Кожне стебло складається з двох антипаралельних ланцюгів, створюючих праву подвійну спіраль, відому як А-форма РНК. Ця форма містить 11 пар підстав на виток, крок спіралі рівний 3.1 нм. Площини підстав складають біля 20° з нормаллю до осі подвійної спіралі. А-форма РНК близька до аналогічної форми ДНК. РНК не здатна міняти конформацію і переходити у В-форму, що обумовлене наявністю 2'-ОН групи в рибозе, якої немає в дезоксирибозе. Просторова (третинна) структура молекули тРНК нагадує формою букву Р. «Щаблину» цієї букви утворює спіраль з акцепторного і Т-стеблей, а антикодоновый і D-стебли формують «ніжку» (рис.17). У кожній частині міститься приблизно 10 пар підстав.

рРНК грають важливу роль в структурі і біосинтетичній функції рибосом — органелл клітки, що складаються з двох субчастинок, на яких відбувається синтез білка. Кожна така частинка утворена молекулами протеїнів і рРНК. Коефіцієнт седиментації рибосом прокариот складає приблизно 70S, а для эукариот він рівний 80S. Своїми власними рибосомами володіють і мітохондрії эукариотических кліток. Їх коефіцієнт седиментації рівний 70S, і вони багато в чому схожі з рибосомами прокариот. 70S-рибосома прокариот складається з 50S- і 30S-субчастиц, а SOS-рибосома эукариот — з 60S- і 40S-субчастиц. Ці субчастинки, у свою чергу, можуть диссоциировать на складові частини — білок і рРНК. Вагове співвідношення між ними для про- і эукариот складає 2:1 і 1:1 відповідно. Більшість рибосомных білків містять в бічних ланцюгах залишки Arg+ і Lys+. Ці позитивно заряджені групи взаємодіють з негативно зарядженими фосфатними залишками молекул рРНК, за рахунок чого стабілізується комплекс протеин-НК. Для деяких молекул рРНК встановлена нуклеотидная послідовність, в якій виявлені ділянки спаровування підстав, створюючі вторинну структуру, подібну тій, що має місце в стеблах молекули тРНК.

Матричний синтез РНК здійснюється за допомогою ДНК-ЗАВІСИМИХ РНК-полімераз, для яких характерна мультисубъединичная структура. У будові цих Ф у прокариот і эукариот є істотні відмінності. Так, в эукариотических клітках представлено три види РНК-полімераз. Їх прийнято позначати римськими цифрами або заголовними буквами латинського алфавіту. РНК-полімераза I (А) локалізована в ядерці, де вона каталізує синтез попередників великих рибосомных РНК; РНК-полімераза II (В) знаходиться в нуклеоплазме і бере участь в синтезі первинного транскрипта мРНК; полимераза III (С) також локалізована в нуклеоплазме і каталізує синтез тРНК і 50S-pPHK.

Ініціація транскрипції відбувається на строго певній ділянці матриці, розташованій після промотора. Останній є ділянкою молекули ДНК, що містить декілька десятків пар підстав і що знаходиться поза межами області, що програмує синтез РНК. У свою чергу синтез РНК завжди починається з підстав А або G в «+»-цепи ДНК, а ділянка скріплення Ф розташована вище за точку ініціації приблизно на 10 підстав.

Елонгация ланцюга РНК наступає після приєднання декілька нуклеозидов. У цей момент РНК-полімераза зазнає структурні зміни: у прокариот від Ф відділяється у-субъединица, а кор-фермент, що залишився, — комплекс (а2вв') субъединиц — каталізує подальше подовження ланцюга РНК. Рухомий уздовж ДНК кор-фермент діє подібно до застібки-блискавки і розкриває подвійну спіраль, яка замикається позаду Ф у міру того, як відповідні підстави РНК злучаються з підставами ДНК в «мінус» — ланцюги.

Термінация ланцюга РНК відбувається на специфічних ділянках ДНК — терминаторах. РНК найчастіше утворюються у вигляді попередників, які, вже без участі матричних систем, перетворюються на зрілі молекули. Всю сукупність перетворень, що відбуваються при цьому, як з РНК, так і з білками називають процесингом. Наприклад, молекули мРНК утворюються з великих за розміром попередників, званих гетероядерной РНК (гяРНК). Для утворення зрілої мРНК з цих молекул ферментативным шляхом віддаляються зайві кінцеві олигонуклеотиды (по 5'- і З'-концам), а також має місце «монтаж» (сплайсинг) — видалення крупних вставних послідовностей, відповідних интронам (некодуючим ділянкам) ДНК, з одночасним возз'єднанням кінців сусідніх экзонов (кодуючих ділянок) в єдиний ланцюг. Нарешті, багато РНК, в першу чергу тРНК, піддаються численним хімічним перетворенням, що приводять до освіти у складі зрілої молекули широкого спектру мінорних компонентів, таких як дигидроуридин, 4-тиоуридин, інозин і ін. Слід підкреслити, що Ф, що беруть участь в транскрипції, є мішенями для ряду БАВ, зокрема антибіотиків і токсинів. Наприклад, токсин блідої поганки - б-аманитин - блокує РНК-полімеразу II эукариот, що приводить до припинення синтезу нових молекул мРНК і багатьох життєво важливих білків.

Тривалий час біологи просто не обертали особливої уваги на короткі відрізки клітинної рибонуклеиновой кислоти (РНК), вважаючи, що їх роль в клітці не дуже значительна. Набагато більший інтерес привертали інші типи РНК, а саме інформаційні і рибосомалъные. Обидва цих класу - дуже довгі молекули, що містять до 100 000 нуклеотидов. Перші (інформаційні, які часто називають також матричними РНК, або мРНК) переносять генетичну інформацію з хромосом (ДНК) в спеціальні органеллы - «агрегати» для синтезу білків - рибосомы. Другий клас - рибосомальная РНК - є одночасно і будівельним матеріалом, і найважливішою робочою частиною рибосом.

Останніми роками була встановлена роль коротких відрізків РНК. Зрозуміло, що з першого погляду малі РНК, що складаються всього з декількох десятків нуклеотидов, могли показатися залишками від своїх «великих братів». І навіть не дивлячись на те, що роль окремих малих молекул РНК в процесах перетворення інформаційних РНК (сплайсинге), а також при упаковці ниток нуклеїнових кислот, була доведена раніше, дійсним «хітом» в біології малі РНК стали тільки з відкриттям своєї здатності пригнічувати експресію генів тварин.

У нормально працюючій клітці кожен ген виконує власну, строго визначену функцію, наприклад, відповідає за вироблення білка, мРНК, або за взаємодію з іншими регуляторними білками. При цьому говорять про нормальну експресію (від латів. expressus - виразний, явний) гена в клітці. Якщо ж кількість продукту даного гена (наприклад, білка) знижується, то говорять про зниження експресії даного гена. Ефект «гасіння» експресії певних генів малими РНК отримав назва РНК - інтерференції, а молекули, що викликають його, назвали siRNA (small interfering Ribonucleic Acids - малі рибонуклеиновые кислоти, що інтерферують). З відкриттям siRNA - інтерференції стало ясно, що цей феномен може мати величезне практичне значення.

У клас малих РНК включають молекули, що містять від 20 до 300 нуклеотидов. За ефект РНК - інтерференції відповідають найкоротші з них - siRNA, що складаються всього з 21-28 (у ссавців з 21-23) нуклеотидов. Особливістю цих молекул є те, що вони, на відміну від більшості інших клітинних РНК, що складаються всього з одного ланцюга нуклеотидов, є двунитчатыми. Нуклеотіди з протилежних ниток (ланцюгів) siRNA злучаються один з одним за тими ж законами комплементарності, які формують двунитчатые ланцюги ДНК в хромосомах. Крім того, по краях кожним з ланцюгів siRNA завжди залишається два неспарених нуклеотида. Як siRNA з'являються в клітці? Очевидно, в клітці повинен існувати якийсь молекулярний механізм, який забезпечував би синтез siRNA, їх накопичення в клітці і дозволяв би їм вимикати гени. Ученим вдалося виявити систему ферментів, яка багато в чому схожа у всіх багатоклітинних і деяких одноклітинних організмів.

Якщо молекула siRNA по тих або інших причинах (наприклад, по волі дослідника) з'являється в клітці, її відразу ж «бере в оборот» спеціальна клітинна система білків, для яких поява siRNA є сигналом до негайної дії. На першому етапі з молекулою siRNA зв'язуються білки-ферменти хеликаза і нуклеаза, формуючи комплекс RISC (RNA-induced silencing complex; silence - англ. мовчати, замовкати; silencing - замовкання, так в англомовній і спеціальній літературі називають процес «виключення» гена). Хеліказа розкручує нитки siRNA, внаслідок чого вони розходяться. Одна з цих ниток, до якої прикріплений фермент нуклеаза, може тепер зв'язатися з комплементарною ділянкою однонитчатой мРНК, дозволяючи нуклеазі розрізати її. Ділянки мРНК, що розрізають же, піддаються дії інших клітинних Рнказ, які доразрезают їх на дрібніші шматки.

Отже, основна «спеціальність» siRNA в клітці - це блокування тих генів, які відповідають одному з ланцюжків усередині siRNA. Але навіщо механізм РНК - інтерференції існує в клітках? Які процеси він покликаний регулювати? Що є ті мРНК, на яких направлено жало малих РНК, і чому їх необхідно знищувати?

Одна з відповідей на питання про необхідність РНК - інтерференції в клітці, напрошується сам собою: за допомогою siRNA клітка може захищати себе від проникнення вірусів. Геном деяких з цих небезпечних варварів складається з ДНК, у деяких же - з РНК, причому, проти звичайних правил, РНК у вірусів може бути як одно-, так і двунитчатой. Сам процес розрізання чужорідної (вірусною) мРНК в цьому випадку відбувається шляхом активацій комплексу ферментів RISC. Проте для більшої ефективності рослини і комахи винайшли своєрідний шлях посилення захисної дії siRNA. Приєднуючись до ланцюга мРНК, ділянка siRNA може за допомогою комплексу ферментів, званого DICER, спочатку добудувати другий ланцюжок мРНК, а потім розрізати її в різних місцях, створюючи, таким чином, різноманітні «вторинні» siRNA. Вони, у свою чергу, формують RISC і проводять мРНК через всі стадії, про які йшла мова вище, аж до її повного знищення. Такі «вторинні» молекули зможуть специфічно зв'язуватися не тільки з тією ділянкою вірусної мРНК, до якого була направлена «первинна» молекула, але також і з іншими ділянками, що різко підсилює ефективність клітинного захисту.

Таким чином, у рослин і нижчих тваринних організмів siRNA є важливою ланкою своєрідного «внутріклітинного імунітету», що дозволяє розпізнавати і швидко знищувати чужу РНК. В тому випадку, якщо в клітку проник РНК - вірус, що містить, така система захисту не дасть йому розмножитися. Якщо ж вірус містить ДНК, система siRNA заважатиме йому проводити вірусні білки (оскільки необхідна для цього мРНК розпізнаватиметься і розрізатиме), і за допомогою цієї стратегії, уповільнить його розповсюдження по організму.

У ссавців же, на відміну від комах і рослин, працює і інша система захисту. При попаданні в «зрілу» (диференційовану) клітку ссавця чужий РНК, довжина якої більше 30 нуклеотидов, клітка починає синтез інтерферону. Інтерферон, зв'язуючись із специфічними рецепторами на клітинній поверхні, здатний стимулювати в клітці цілу групу генів. В результаті в клітці синтезується декілька видів ферментів, які гальмують синтез білків і розщеплюють вірусні РНК. Крім того, інтерферон може діяти і на сусідні, ще не заражені клітки, блокуючи тим самим можливе розповсюдження вірусу.

Як можна відмітити, обидві системи багато в чому схожі: у них загальна мета і «методи» роботи. Навіть самі назви «interferon» і «(RNA) interference» походять від загального кореня. Але є у них і одна дуже істотна відмінність: якщо інтерферон при перших ознаках вторгнення просто «заморожує» роботу клітки, не дозволяючи (про всяк випадок) виробництво багато, у тому числі і «невинних» білків в клітці, то система siRNA відрізняється надзвичайною розбірливістю: кожна siRNA розпізнаватиме і знищуватиме тільки свою, специфічну мРНК. Заміна всього лише одного нуклеотида усередині siRNA веде до різкого зниження ефекту інтерференції.

У цьому і полягає основна перевага малих РНК: жоден з блокаторов генів, відомих до цих пір, не володіє такою винятковою специфічністю по відношенню до свого гена-мішені. Проте, як видно на прикладі багатьох небезпечних вірусних захворювань у людей, ні імунна, ні интерфероновая захист не всесильні, так що нам самий час запозичити у кого-небудь передовий досвід в боротьбі з вірусами. Чом би не у рослин або у комах? Ні ті, ні інші не володіють системою адаптивного імунітету. Щоб вижити, рослини були вимушені «винайти» РНК - інтерференцію, яка до цих пір успішно захищає їх клітки від впровадження вірусів. З'являється цілком закономірне питання: чи не можна застосувати цей же підхід відносно кліток тварин і людей?

Відкриття siRNA, дає нову надію в боротьбі з вірусами, зокрема СНІДУ, а також з тими, кого підозрюють в співучасті при розвитку раки. Висока специфічність і ефективність укупі з низькою токсичністю будуть тут як не можна до речі. Як очікується, застосовуючи терапію siRNA разом з традиційною антивірусною терапією, можна досягти ефекту потенціювання, коли дві дії приводять до більш вираженого лікувального ефекту, ніж проста сума кожного з них, вживаного окремо.

Для того, щоб використовувати механізм siRNA - інтерференції в клітках ссавців, всередину кліток потрібно ввести вже готові двухцепочечные молекули siRNA. Оптимальний розмір таких синтетичних siRNA при цьому складає ті ж 21-28 нуклеотидов. Якщо збільшити її довжину - клітки відповідять виробленням інтерферону і зниженням синтезу білка. Синтетичні siRNA можуть потрапити як в заражені, так і в здорові клітки, і зниження вироблення білків в незаражених клітках буде украй небажаним. З іншого боку, якщо спробувати застосовувати siRNA менші, ніж 21 нуклеотид, різко знижується специфічність її пов'язання з потрібною мРНК і здібністю до формування комплексу RISC.

Так якщо вдасться тим або іншим способом доставити siRNA, що володіє здатністю зв'язуватися з якою-небудь ділянкою генома ВІЧ (який, як відомо, складається з РНК), можна спробувати не допустити його вбудовування в ДНК клітки господаря. Крім того, учені розробляють шляхи дії на різні етапи розмноження ВІЧ у вже зараженій клітці. Останній підхід не забезпечить лікування, проте може істотно зменшити швидкість розмноження вірусу і дати загнаній в кут імунній системі шанс «відпочити» від вірусної атаки, і самій спробувати розправитися із залишками захворювання.

Як припускають, роль коротких РНК в клітці не обмежується тільки захистом від вірусів і інших чужорідних РНК. Вони, виявляється, були створені, щоб захистити нас... від нас самих.

Річ у тому, що геном будь-якого багатоклітинного організму включає безліч елементів, які колись були привнесені в нього в процесі еволюції ззовні, наприклад як результат вбудовування вірусу. Судите самі: зі всього матеріалу, що міститься в наших з вами хромосомах, 34% припадає на частку елементів, званих LINEs і SINEs (відповідно, Long і Short Interspersed Nuclear Elements), про функції яких відомо тільки те, що вони можуть по часах копіювати себе і переміщатися з одного місця хромосоми на інше; ті ділянки ДНК, яка дісталася нам від ретровірусів (8% генома) і транспозоны (3%) також здатні міняти своє місце в геномі. На їх фоні всього лише 2 (два(!)) відсотки власне генів, що кодують наші клітинні білки, здаються такою ж маловажною деталлю, як і siRNA серед величезної різноманітності своїх великих «сестер».

LINEs, SINEs, залишки вірусної ДНК і транспозоны, за свою здібність до переміщень іменовані рухомими, або мобільними елементами генома, представляють значну небезпеку для наших хромосом. «Чужі серед своїх», вони при певних обставинах можуть підняти бунт і привести до внутріклітинного хаосу. Деякі з них - залишки вірусів, або протоонкогены - здатні при «включенні» викликати рак; мобільні елементи, розмножуючись і переміщаючись, міняють структуру хромосом, що може привести до мутацій. Наприклад, у улюбленого об'єкту генетичних досліджень - плодової мушки дрозофилы - більше 80% спонтанних мутацій виникають саме із-за «хуліганської» поведінки її власних мобільних елементів. Їх переміщення усередині генома такі індивідуальні і непередбачувані, що положення деяких з них може служити «молекулярним паспортом», що точно визначає особу господаря, що вже використовується на практиці.

Зрозуміло, що кожному організму необхідно було розробити систему жорсткого контролю поведінки мобільних елементів. Якраз цю «наглядацьку» функцію, як вважають учені, і виконує система внутріклітинних siRNA. На моделі все того ж З. elegans, наприклад, було показано, що відключення генів, що кодують деякі з малих РНК, веде до активізації переміщень мобільних елементів в його хромосомах і, відповідно, до підвищення рівня мутацій.

Крім того, помилки в розвитку органів і тканин при відключенні генів, що кодують систему siRNA у піддослідних тварин, а також її активність в «незрілих» клітках указують на те, що механізм РНК - інтерференції активно бере участь в регуляції програми «дозрівання» кліток і, як наслідок, може грати одну з ключових ролей у формуванні цілісного організму.

Ще одна з передбачуваних нормальних функцій siRNA - відстежування неправильно оброблених копій інших типів РНК в клітці.

Нарешті, в 2002 році дослідники несподівано з'ясували, що дія siRNA може не обмежуватися тільки тимчасовим виключенням генів на рівні РНК. Є дані, що в деяких випадках siRNA, мабуть, впливає прямо на ДНК, змінюючи структуру хроматина і сприяючи тривалому «замовканню» одних, і, можливо, активізації інших генів.

Як здійснюються всі ці функції siRNA, які їх молекулярні деталі? Звідки, наприклад, може з'являтися та необхідна для запуску реакції РНК - інтерференції молекула двухцепочечной РНК? Якщо вона створюється в клітці навмисно, то які ферменти відповідають за її створення? Які властивості сигналізують про те, що молекула одноцепочечной РНК «не своя» або помилкова і підлягає знищенню? Які особливості функціонування системи siRNA у різних організмів, і чому вони виникли саме у такому вигляді? Як з'являються siRNA в клітці ссавців, у яких поки не виявлені ферменти, відповідальні за добудовування другого ланцюжка siRNA?

На цих і багато інших питань відповідей поки немає. Кожне нове питання примушує майбутніх професорів і академіків, Нобелівських лауреатів і призерів Science шукати відповідь тільки потім, щоб поставити нові питання наступним поколінням.