Методи лабораторної діагнсотики вірусних інфекцій

Мікроскопічний Вірусоскопія	Вірусологічний	Серологічний
Накопичення	Індикація	Ідентифікація
Електронна мікроскопія - Особливо вірусів, які не культивуються: ротавіруси, віруси гепатиту А, кишкові аденовіруси та інші.   Метод флюоресцуючих антитіл (МФА) - Виявлення вірусних антигенів в патологіч-ному матеріалі Виявлення специфічних включень тільця Гварнієрі, тільця Бабеша-Негрі.	І. Культура клітин 1) первинно- трипсинізована; 2) перещеплю-вальна.   ІІ. Курячі ембріони   ІІІ. Чутливі тварини	ЦПД (змінення клітин під впливом вірусів): 1)вогнещева деструкція; 3) гроно- утворення; 3) симпласто- утворення; 4)трансформація клітин. РГАдс РГА     Хвороба та загибель інфіко-ваних тварин	Реакція нейтралізації (РН) на культурі клітин   РГГАдс РГГА     РН на тваринах. Виявлення специфічних внутрішньоклітинних включень (наприклад: тільця Бабеша-Негрі) та інші	Дослідження парних сироваток: ІФА,РЗК, РГГА, РПГА та інші   Молекулярно-генетичний метод. ПЛР – збільшення генетичного матеріалу віруса та його ідентифікація.

Лабораторна діагностика вірусних інфекцій

На перший план діагностики виступають виявлення збудника та виділення його з організму хворого. Пошук та виявлення специфічних змін в організмі під впливом вірусу мають значення більше для постановки діагнозу ретроспективно.

Вірусоскопічне дослідження має обмежене використання у зв‘язку з тим, що розміри більшості вірусів знаходяться за межами дозволяючої здатності світлового мікроскопу та можуть бути досліджені за допомогою електронної мікросокпії.

Вірусологічне дослідження складається з трьох етапів:

1. накопичення;

2. виявлення вірусу;

3. ідентифікація вірусу.

Загальним принциповим положенням при виділенні вірусу є їх культивування на живій клітині (культура клітин, курячий ембріон, організм тварини).

 

Накопичення та виявлення вірусів на культурі клітин

Досліджуваний матеріал, в якому припустимо знаходиться цікавлячий нас вірус, суспендують в невеликому об’ємі культурального середовища, фільтрують через міліпоровий фільтр для видалення бактерій і вносять в культуральний флакон, який містить моношарову культуру сприйнятливих клітин. Через 48 – 72 години реєструють появу змін. Простим оком видно повну чи часткову деградацію моношару і його злущування з поверхні флакона. Морфологічні зміни клітин виявляють за допомогою інвертованого мікроскопа.

Зараження курячих ембріонів

Білок

Інокуляція у алантоїсну порожнину

Інокуляція у хоріоналантоїсну мембрану

Хоріоналан-тоїсна мембрана

Жовточний мішок

Алантоїсна порожнина

Повітряний мішок

Досліджуваний матеріал вводять в алантоїсну чи амніотичну порожнини, хоріоналантоісну оболонку або жовтковий мішок курячого ембріона. Перед зараженням шкаралупу яйця дезінфікують етанолом і йодом. На овоскопі встановлюють межі повітряної камери, розтинають її та шприцем 0,1 – 0,2 мл досліджуваного матеріалу на 2 – 3 мм нижче межі повітряного пухирця. Отвір в шкарулупі заліплюють. Розтин заражених ембріонів здійснюють через 48 – 72 години інкубації при 37°С. Шкаралупу знову оброблюють спиртом і 2 % розчином йоду, розтинають її ножицями, знімають її оболонку і вивчають хоріон-алантоісну оболонку в районі зараження, відмічаючи геморрагії та інші ураження.

 

 

Виявлення вірусів в клітинних культурах

Та їх ідентифікація.

Існують первинно-трипсоннізовані та перещеплювані клітинні культури. Первинно-трипсонізовані культури отримують безпосередньо із тканини тварини чи людини шляхом руйнування трипсином міжклітинної речовини. Отримані таким чином клітини переносять в посудину з поживним (культуральним) середовищем, в якому вони зберігають життєздатність на протязі ряду генерацій, завдяки чому їх можна кілька разів пасировать. Такі первинні культури високочутливі до ряду вірусів і широко використовуються в вісурології.

Перещеплювані культури здатні витримувати необмежену кількість пасажів, оскільки отримані із трансформованих або пухленних клітин.

По характеру росту культури діляться на моношарові та суспензійні. Добре прикріплюються до підложки і ростуть в моношарі епітеліальні клітини та фібробласти. Клітини системи крові формують, як правило, суспензійні лінії. Живильні середовища, що використовуються для культур клітин, можуть бути ростовими та підтримувальними. Ростові містять поряд з іншими компонентами 5-15% сироватки кровітварин і сприяють розмноженню клітин, швидкому росту й формуванню моношарових культур. Для виживання клітин у вже сформованому моношарі використовують підримувальні середовища, де міститься близько 2% сироватки крові тварин. Також існує класифікація живильних середовищ за походженням: природні та синтетичні.

Виявлення (індикація) вірусів

Цитопатична дія (ЦПД) (індикація вірусів на культурі клітин) являє собою дегенеративні зміни в клітинах, які з’являються в результаті репродукції в них вірусів. Характер ЦПД залежить в основному від:

· виду вірусу;

· дози вірусу;

· властивостей клітин та умов їх культивування.