Энзимодиагностика: классификация ферментов клетки, крови в энзимодиагностике, диагностическое значение, применение в педиатрии

Энзимодиагностика – методы диагностики болезней, патологических состояний и процессов, основанные на определении активности ферментов в биологических жидкостях.

Классификация ферментов плазмы крови по происхождению:

1) Секреторные ферменты - секретируются определенными органами в плазму крови, где и выполняют свою функцию. Например: ЛПЛ, ЛХАТ, ферменты свертывающей и противосвертывающей системы крови;

2) Экскреторные ферменты - синтезируются в железах ЖКТ, выделяются в просвет ЖКТ, где обеспечивают процесс пищеварения. В кровь эти ферменты попадают при повреждении желез. Например, при панкреатите в крови обнаруживается панкреатическая липаза, амилаза, трипсин и т.д., при воспалении слюнных желез - амилаза слюны.

3) Клеточные ферменты - функционируют только внутри клеток, в плазму крови они попадают во время повреждения (под действием медиаторов воспаления и т.д.) и гибели клеток (при некрозе). К ним относятся общие, органо- и органеллоспецифические ферменты. За счет естественной гибели клеток клеточные ферменты имеют в плазме крови постоянно низкую активность. При поражении органа происходит значительный выход ферментов из его клеток и многократное увеличение активности этих ферментов в плазме крови.

Ферменты клетки:

1) Аминотрансферазы. Локализуются в митохондриях, обеспечивают взаимопревращения аминокислот и кетокислот: АК1 + КК2 ↔ КК1 + АК2.

a. АСТ: асп+α-КГ ↔ ЩУК+глу. АСТ много в миокарде, по убыванию меньше в печени, скелетной мускулатуре, ЦНС, почках, семенниках.

b. АЛТ: ала+α-КГ ↔ ПВК+глу. АЛТ много в печени, поджелудочной железе, миокарде, скелетной мускулатуре.

Активность обеих трансаминаз в сыворотке крови возрастает в десятки раз при инфаркте миокарда (АСТ>АЛТ), при остром инфекционном гепатите (АЛТ>АСТ), а также при циррозе печени и мышечной дистрофии.

2) ЛДГ и КК. Относятся к некротическим ферментным методам.

a. ЛДГ. Локализуется в цитозоле, обеспечивает взаимопревращения ПВК и лактата. ПВК+ НАДН2 ↔ лактат + НАД+.

ЛДГ₁ и ЛДГ₂ наиболее активны в сердечной мышце и почках.

ЛДГ₄ ЛДГ₅ - в скелетных мышцах и печени.

При инфаркте миокарда в сыворотке крови резко повышается активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂, а при поражениях скелетной мускулатуры и печени повышается активность ЛДГ₄ ЛДГ₅.

b. КК. Локализуется в цитозоле, митохондриях, миофибриллах. Креатин + АТФ ↔ креатинфосфат + АДФ.

Изофермент КК-ВВ находиться преимущественно в головном мозге

МВ – в миокарде

ММ – в скелетных мышцах.

В сыворотке крови КК-ММ повышается при повреждении скелетных мышц, КК-МВ - при инфаркте миокарда. КК-ВВ не проходит гематоэнцефалический барьер и не имеет значения для диагностики патологий ЦНС.

Диагностическое значение:

В сыворотке крови повышена активность амилазы - острый панкреатит, киста поджелудочной железы;
γ-глутамилтранспептидазы - острый инфекционный или токсическый гепатит, хронический гепатит, цирроз печени;
кислой фосфатазы - карцинома простаты;
щелочной фосфатазы - заболевания костей, закупорка желчных протоков, при беременности и у детей.

Определение активности ферментов с диагностической целью проводят также в моче, слюне, ликворе и биоптатах органов и тканей.

Нормальные значения активности ферментов у детей отличаются от нормальных значений у взрослых.

11. Биохимические основы энзимотерапии, применение ферментов в энзимотеравии (примеры)

Энзимотерапия – применение ферментов животного, бактериального или растительного происхождения и регуляторов активности ферментов с лечебной целью.

1) Протеолитические ферменты применяются при нарушении пищеварения.

Пример:

a. Экстракты слизистой оболочки желудка, основным действующим веществом которых является пепсин. Их в основном используют для коррекции секреторной дисфункции желудка.

b. Панкреатические энзимы, представленные амилазой, липазой, трипсином и химотрипсином. Их используются для коррекции нарушений процесса пищеварения, а также для регуляции функций поджелудочной железы.

c. Комбинированные ферменты, содержащие панкреатин в комбинации с компонентами желчи, гемицеллюлозой. Их назначают при недостаточной внешнесекреторной функции поджелудочной железы в сочетании с патологией печени, желчевыводящей системы, при нарушении жевательной функции, малоподвижном образе жизни, кратковременных погрешностях в еде.

d. Растительные энзимы, представленные папаином, грибковой амилазой, протеазой, липазой и др. ферментами. Папаин и протеазы гидролизируют белки, грибковая амилаза - углеводы, липаза - жиры.

e. Дисахаридазы.

2) Протеолитические препараты применяют местно, в виде аппликаций или орошений, при первичной обработке ран и ожогов. Гидролизуя белки некротизированных тканей, ферменты способствуют очищению раны, уменьшению воспаления и ускорению заживления.

Пример:

a. Коллагеназа вызывает деструкцию коллагена при этом жизнеспособные мышцы, грануляционная ткань и эпителий остаются интактными. При гнойных ранах коллагеназа способствует быстрому очищению от нежизнеспособных тканей и экссудата, более раннему появлению грануляционной ткани и эпителизации, предупреждает развитие грубых рубцов, способствует сохранению функции суставов.

b. Гиалуронидазы – ферменты, специфическим субстратом которых является гиалуронованная кислота, основа межклеточного матрикса соединительной ткани. Показателями к их применению являются рубцы после ожогов и операций, гематомы, контрактуры суставов и т.д. Лечебный эффект проявляется размягчением рубцов, рассасыванием гематом, появлением подвижности в суставах.

c. Протеолитические ферменты применяют для предотвращения и лечения тромбозов, эмболии, инфаркта миокарда, закупорки сосудов сетчатки глаза.

d. Нуклеазы (ДНК-аза, РНК-аза) используют при лечении некоторых вирусных заболеваний. Фермент разрушает ДНК вируса, не повреждая вместе с тем ДНК клеток макроорганизма.

e. Бактериолитические ферменты. Препарат обладает наибольшей бактерицидной активностью по отношению к грамположительным бактериям: стафилакоккам, стрептококкам, а также менингококкам, гонококкам. Особенность, препарат показывает высокую бактерицидную эффективность вне зависимости от устойчивости бактерий к действию антибиотиков.

Энзимотерапию применяют в случае недостаточности ферментов, либо вместе с другими препаратами.

Цикл Кребса - схема реакций, ферменты, коферменты, энергетический баланс одного оборота. Тканевые особенности в детском возрасте, Регуляция.

Цикл Кребса.

ЩУКа "съела" ацетат,

Получается цитрат.

Через cis-аконитат

Будет он - изоцитрат.

Водороды отдав НАД,

Он теряет СО 2.

Этому безмерно рад

Альфа -кето- глутарат.

Окисление грядет:

НАД похитит водород,

В 1 и липоат

С коэнзимом А спешат,

Отбирают СО 2.

А энергия едва

В сукциниле появилась,

Сразу АТФ родилась.

И остался сукцинат.

Вот добрался он до ФАДа -

Водороды тому надо.

Водороды потеряв,

Стал он просто фумарат.

Фумарат воды напился,

Да в малат и превратился.

Тут к малату НАД пришел,

Водороды приобрел.

ЩУКа снова объявилась

И тихонько затаилась

Караулить ацетат...

Ферменты в этой схеме есть.

Коферменты - это НАД, НАДФ, АТФ, ГТФ? Тогда есть.

Схема:

Образовавшиеся молекулы ЩУК реагируют с новой молекулой Ацетил-КоА и цикл повторяется вновь.

Энергетический баланс одного оборота: 3 НАДН₂ + 1 ФАДН₂ (направляются далее в дыхательную цепь окислительного фосфорилирования) + 1 ГТФ (НАДН₂ -> 3 АТФ, ФАДН₂ -> 2 АТФ, ГТФ -> 1 АТФ) = 12 АТФ.

Регуляция ЦТК: 4 регуляторных фермента: цитратсинтазы, изоцитрат ДГ, α-КГ ДГ и СДГ. ЦТК ингибируется в основном НАДН₂ и АТФ, которые являются продуктами ЦТК и цепи окислительного фосфорилирования. Активируют ЦТК в основном НАД⁺ и АДФ.

Оксидазный путь использования кислорода в клетке - митохондриальное окислительное фосфорилирование. Состав дыхательных комплексов редокс-цепи, локализация и функции, тканевые особенности в детском возрасте. Регуляция.

Оксидазный путь использования кислорода в клетке:

Протекает в митохондриях, потребляет 90% О₂ и обеспечивает процесс окислительного фосфорилирования.

Окислительное фосфорилирование - синтез АТФ из АДФ и Н₃РО₄ за счет энергии движении электронов по дыхательной цепи.

Оно является основным источником АТФ в аэробных клетках

Окислительное фосфорилирование состоит из процессов окисления и фосфорилирования.

1) Процесс окисления

Процесс окисления происходит при движении электронов по дыхательной цепи от субстратов тканевого дыхания на кислород. Дыхательная цепь окислительного фосфорилирования состоит из 4 белковых комплексов, встроенных во внутреннюю мембрану митохондрий и небольших подвижных молекул убихинона и цитохрома С, которые циркулируют в липидном слое мембраны между белковыми комплексами.

a. Комплекс I – НАДН₂ дегидрогеназный комплекс – самый большой из дыхательных ферментных комплексов, в качестве коферментов содержит ФМН и 5 железосерных (Fe₂S₂ и Fe₄S₄) белков.

b. Комплекс II – СДГ. В качестве коферментов содержит ФАД и железосерный белок.

c. Комплекс III – Комплекс b-c₁ (фермент QH₂ ДГ). Каждый мономер содержит 3 гема, связанных с цитохромами b₅₆₂, b₅₆₆, с₁, и железосерный белок.

d. Комплекс IV – Цитохромоксидазный комплекс. Каждый мономер содержит 2 цитохрома (а и а₃) и 2 атома меди.

e. Коэнзим Q (убихинон). Переносит по 2Н⁺ и 2е^-.

f. Цитохром С. Периферический водорастворимый мембранный белок. Содержит молекулу гема.

Этапы движения е^- по дыхательной цепи

a. 2е^- от НАДН₂, проходят через I комплекс (ФМН→SFe белок) на КоQ, высвобождаемая при этом энергия обеспечивает перекачку Н⁺.

b. КоQ с 2е^- забирает у воды 2Н⁺ из матрикса и превращается в КоQН₂ (восстановление КоQ проходит также с участием комплекса II).

c. КоQН₂ переносит 2е^- на комплекс III, а 2Н⁺ в межмембранное пространство.

d. Цитохром С переносит е^- c III комплекса на IV комплекс.

e. IV комплекс сбрасывает е^- на О₂, высвобождаемая при этом энергия обеспечивает перекачку Н⁺.

Образовавшийся на внутренней мембране митохондрий электрохимический потенциал используется для:

a. фосфорилирования АДФ в АТФ;

b. транспорта веществ через мембрану митохондрий;

c. теплопродукцию.

2) Процесс фосфорилирования

Процесс фосфорилирования осуществляется АТФ-синтетазой (Н⁺-АТФ-аза), которая потребляет 40-45% свободной энергии, выделившейся при окислении. Н⁺-АТФ-аза интегральный белок внутренней мембраны митохондрий, она состоит из 2 белковых комплексов F₀ и F₁.

a. Гидрофобный комплекс F₀ погружён в мембрану и служит основанием, которое фиксирует АТФ-синтазу в мембране. Он состоит из нескольких субъединиц, образующих канал, по которому протоны переносятся в матрикс.

b. Комплекс F₁ выступает в митохондриальный матрикс. Он состоит из 9 субъединиц (3α, 3β, γ, δ, ε). Субъединицы α и β уложены попарно, образуя «головку»; между а- и β-субъединицами располагаются 3 активных центра, в которых происходит синтез АТФ; γ, δ, ε – субъединицы связывают комплекс F₁, с F₀.

АТФ-синтетаза обеспечивает обратимое взаимопревращение энергии электрохимического потенциала и энергии химических связей.

Электрохимический потенциал внутренней мембраны заставляет Н⁺ двигаться из межмебранного пространства по каналу АТФ-синтазы в матрикс митохондрий. При каждом переносе протонов через канал F_o энергия электрохимического потенциала расходуется на поворот стержня, в результате которого циклически изменяется конформация а- и β-субъединиц и все 3 активных центра, образованных парам α- и β-субъединиц, катализируют очередную фазу цикла: 1) связывание АДФ и Н₃РО₄; 2) образование фосфоангидридной связи АТФ; 3) освобождение конечного продукта АТФ.