Некоторые распространенные и специальные методы оптической микроскопии

1. Метод светлого поля в проходящем свете.

Наиболее распространенный метод для исследования прозрачных окрашенных и неокрашенных объектов. Объект освещается снизу и выглядит цветным на светлом поле. Контраст изображения тем больше, чем большим поглощением в видимой области спектра обладают различные участки объекта.

2. Метод темного поля в проходящем свете.

Применяется для наблюдения прозрачных окрашенных и неокрашенных объектов. В объектив попадает только свет, рассеянный элементами структуры препарата. На темном поле получают светлое изображение; благодаря большой контрастности отдельные детали видны лучше, чем при методе светлого поля.

3. Методы светлого и темного поля в отраженном свете.

Используются для изучения непрозрачных объектов.

4. Интерференционная микроскопия.

Служит для получения изображения прозрачных и бесцветных объектов, живых и фиксированных, не видимых при наблюдении по методу светлого поля. При этой методике наблюдается интерференционная картина, получаемая в результате соединения двух когерентных лучей, один из которых проходит через объект, а другой - мимо него.

5. Поляризационная микроскопия.

Используется для наблюдения в поляризованном свете объектов, обладающих оптической анизотропией.

6. Люминесцентная микроскопия.

Позволяет выявить люминесцирующие структуры.

7. Ультрафиолетовая микроскопия.

См. раздел «Разрешающая способность микроскопа».

8. Стереоскопическая микроскопия.

Позволяет получить объемное изображение. Специальные стереомикроскопы используются при проведении микрохирургических операций.

9. Микрофотография.

Методика фотографирования изображения, полученного с помощью микроскопа.

ИЗМЕРЕНИЕ ЛИНЕЙНЫХ РАЗМЕРОВ МАЛЫХ ОБЪЕКТОВ

С ПОМОЩЬЮ МИКРОСКОПА

Для определения размеров микроскопических объектов используют окулярный микрометр - стеклянную пластинку со шкалой. При измерении изображение шкалы совмещают с изображением изучаемого объекта. Цену деления шкалы окулярного микрометра находят с помощью объекта-микрометра, шкалы с известной ценой деления, или любого предмета, размер которого известен.

Упрощенный и удобный метод определения линейных размеров малых объектов с помощью микроскопа рассматривается в данной работе. При этой методике с помощью микроскопа зарисовывается изображение предмета с известными размерами. По величине зарисовки изображения и размеру предмета вычисляют увеличение микроскопа. Затем зарисовывают изображение исследуемого объекта. По размерам изображения и увеличению микроскопа определяют размер исследуемого объекта.

 

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1. Измерить микрометром толщину проволоки d пять раз. Данные занести в таблицу 1.

2. Вычислить среднее значение диаметра , значение и сумму .

3. Расположить проволоку на предметном столике микроскопа. Получить изображение проволоки при большом увеличении.

Примечание. Для получения изображения при большом увеличении необходимо сначала найти объект при малом увеличении, расположить проволоку по диаметру поля зрения, после чего заменить объектив малого увеличения на объектив большого увеличения).

4. Рядом с микроскопом на расстоянии наилучшего зрения 25 см на подставку положить лист чистой бумаги. Смотря одним глазом в окуляр, а другим на лист бумаги, зарисовать 5 раз увеличенное изображение проволоки так, чтобы контур изображения на бумаге был кажущимся продолжением изображения, видимого в окуляр. Измерить линейкой ширину изображения проволоки D. Результаты занести в таблицу 1. Определить среднее значение размера изображения , вычислить и сумму и занести в таблицу 1.

Таблица 1

№ измер.	Толщина проволоки di, мм			Размер изображения проволоки Di, мм
Сумма		-------			-------
Среднее		-------	-------		-------	-------

 

5. Определить среднее значение увеличения микроскопа по формуле

.

6. Вычислить среднюю относительную погрешность измерения :

.

а) среднюю абсолютную погрешность толщины проволоки вычислить по формуле

,

где - случайная погрешность, D_пр - погрешность прибора, D_окр - погрешность округления. При коэффициенте надежности a = 0,95 и количестве измерений n =5 случайная погрешность определяется по формуле

=2,8× .

Для микрометра D_пр=0,007 мм, D_окр = 0,005 мм;

б)среднюю абсолютную погрешность ширины изображения проволоки вычислить по формуле (a=0,95; n = 5)

.

В данной работе D_пр и D_окр обычно не превышают половины случайной погрешности, и ими можно пренебречь.

7. Определить среднюю абсолютную погрешность увеличения микроскопа:

= .

8. Записать окончательный результат для увеличения микроскопа в виде

.

9. Расположить на предметном столике микроскопа предметное стекло с волосом или гистологический препарат поперечно-полосатой мышцы.

Получить изображение волоса (одиночного мышечного волокна) при большом увеличении (примечание, п.3).

10. Сделать зарисовку увеличенного изображения объекта, как указано в п.4.

11. Измерить линейкой ширину изображения объекта L. Данные занести в таблицу.Определить среднее значение размера изображения вычислить и сумму и занести в таблицу 2.

Таблица 2.

№ измер.	Размер изображения объекта L, мм
Сумма		-------
Среднее		-------	-------

 

12. Определить ширину малого объекта (волоса, мышечного волокна):

.

13. Вычислить среднюю относительную погрешность измерения :

;

а) значение величины взять из п. 6;

б) среднюю абсолютную погрешность ширины изображения объекта вычислить по формуле (При расчете пренебречь D_пр и D_окр; см.п.6,б)

, (a=0,95; n = 5).

14. Определить среднюю абсолютную погрешность линейного размера малого объекта

.

15. Окончательный результат для линейного размера малого объекта записать в виде

(мм).

16. Вычислить увеличение микроскопа К по параметрам объектива и окуляра, с которыми проводилась работа: K=K _об × K _ок.

Данную величину сравнить со значением увеличения микроскопа, полученным в работе опытным путем.

17. Вычислить предел разрешения микроскопа Z по параметрам объектива, с которым производилась работа. Длину волны света, освещающего препарат, принять равной 600 нм: .

Полученное значение сравнить с размером малого объекта, величина которого определялась в работе.

18. Вычислить полезное увеличение микроскопа по параметрам объектива, с которым проводилась работа, предел разрешения глаза на расстоянии наилучшего зрения Z_r принять равным 200 мкм, длину волны света, освещающего препарат, - равной 600 нм:

.

Полученное значение сравнить с увеличением микроскопа, при котором определялась величина малого объекта.

 

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Устройство биологического микроскопа.

2. Ход лучей в микроскопе.

3. Увеличение микроскопа.

4. Понятие о разрешающей способности микроскопа. Роль дифракции света в формировании изображения.

5. Апертурный угол объектива микроскопа. Роль этого угла в повышении качества изображения.

6. Предел разрешения микроскопа. Формула для определения предела разрешения.

7. Пути повышения разрешающей способности. Иммерсионные системы.

8. Полезное увеличение микроскопа.

9. Некоторые специальные методы оптической микроскопии.

10. Методы измерения линейных размеров малых объектов с помощью микроскопа.

 

 

Лабораторная работа № 12