В изоэлектрическом состоянии.

Изоэлектрическое состояние оказывает влияние на структуру белков и их растворов. Для изоэлектрической точки характерно свертывание макромолекул белка в клубки; в заряженном состоянии цепи белков имеют вытянутую форму.

Схематичное изображение структур белков:

а) глобулярная структура (pH = pI);

б) фибриллярная струк­тура с отрицательным зарядом (pH > pI);

в) фибриллярная струк­тура с положительным зарядом (pH < pI).

Кроме того, в изоэлектрическом состоянии уменьшается сольватная оболочка белка т.к отсутствует мощная электростатическая сольватация. Поэтому вблизи изоэлектрической точки могут происходить коренные изменения в свойствах белков и их растворов.

Так в изоэлектрической точке минимальны электропроводность, устойчивость и набухание белков, а так же вязкость и осмотическое давление растворов белков и максимальны процессы коагуляции и желатинирования.

 

Электрофорез.

Электрофорез (от электро… и греческого рhoresis – перенесение) – направленное перемещение заряженных частиц в дисперсионной среде под действием внешнего постоянного электрического поля к противоположно заряженному электроду.

Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как

· размеры (или молярная масса),

· пространственная конформация,

· электрический заряд

причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим зарядом мигрируют в направлении катода или анода. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса разделения смеси белков методом электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны или фракции, содержащие  одинаковые молекулы.

Факторы, влияющие на электрофоретическую подвижность

Молекула белка в растворе при любом значении рН, отличающемся от изоэлектрической точки, имеет определенный заряд. Это приводит к тому, что белок движется в электрическом поле (макрокатион к катоду, макроанион к аноду). На электрофоретическую подвижность белковых молекул влияют следующие факторы:

Ø Размер и форма макромолекулы.

Ø Заряд макромолекулы

Чем больше величина заряда белковой молекулы, тем выше ее электрофоретическая подвижность из-за увеличения силы электростатического притяжения с противоположно заряженным электродом.

Ø Напряженность электрического поля (Н, В/м)

Ø Характер буферного раствора

Электрофорез сыворотки крови обычно проводят при нейтральных или слабощелочных рН = 8,6, когда большинство белков мигрирует к аноду.

Ø Природа носителя

Чаще всего в качестве носителей используют относительно инертные вещества, но их состав все же оказывает влияние на подвижность разделяемых веществ, и, выбор носителя зависит от природы образца.

Методы электрофореза

Существует множество разновидностей и модификаций метода электрофореза, которые используются в различных областях.

Выделяют три основных типа электрофоретических систем: электрофорез с подвижной границей, зональный электрофорез и стационарный (вытесняющий) электрофорез.

 

Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков. В случае использования иммунологических методов для выявления разделенных белков используется иммуноэлектрофорез.

Зональный электрофорез

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. При этом методе разделение производят в закрепленной среде. Наиболее распространены методы разделения на пористых носителях.

Электрофорез на бумаге. Электрофорез проводят с использованием боратных, фосфатных или веронал-мединаловых буферных растворов. Носителем служит специальная хроматографическая бумага, которую разрезают на полоски требуемого размера. Наносят сыворотку крови на катодный конец смоченной буферным раствором полоски. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов. Скорость движения белков пропорциональна величине их электрического заряда. За определенное время белковые фракции пройдут различный путь и разделятся.

 

Схема прибора для электрофореза на бумаге.

 

Затем белки фиксируют высушиванием и красят красителями. Окрашенные зоны белковых фракций вырезают и элюируют специальным растворителем (раствор NaOH) для фотометрического определения каждой фракции. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови получается до 5 фракций: альбумины, a ₁ -, a ₂ -, b-, g-глобулины.

 

Электрофореграмма сыворотки крови на хроматографической бумаге:

1 – альбумин, 2 – a ₁ -глобулин, 3 – a ₂ -глобулин, 4 – b-глобулин, 5 – g-глобулин.

 

Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране. Мембрана ацетатцеллюлозы как носитель для электрофореза имеет ряд преимуществ по сравнению с бумагой: однородность, строго определен­ный размер пор, пониженная адсорбционная способность, что исключает образование размытых полос позади зон. Для окрашивания зон применяют методы аналогичные методам окрашивания зон на бумаге.

Электрофорез в гелях. В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агар-агаровый, полиакриламидный гели. Характерной особенностью этой разновидности зонального электрофореза является его высокая разрешающая способность, поскольку гели функционируют как молекулярные сита: крупные молекулы проходят сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле. Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выявляется до 7-8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле – до 20 фракций. Агаровый гель ввиду большого количества воды в нем и вследствие этого большой скорости движения ионов используется в иммуноэлектрофорезе для обнаружения антигенов. Самым перспективным является полиакриламидный гель, так как он прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен, размер пор у этого геля можно варьировать в широких пределах и его можно использовать с самыми различными буферными растворами. Скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе.

 

Фотография электрофореграмм смеси белков, разделенных в полиакриламидном геле, иллюстрирующая разделение белков по заряду и молекулярной массе.

 

Вариантов проведения электрофореза в полиакриламидном геле много (вертикальный в трубках и горизонтальный на пластинах).

 

 

 

Схема простейшего прибора для электрофореза в геле а - до фракционирования, б - после его окончания

Схема прибора для электрофореза в горизонтальных пластинах 1 -антиконденсационная крышка; 2 – электродный резервуар; 3 - колодец для внесения препарата; 4 - гель; 5 - фитиль; 6- охлаждающий столик