Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Относительная количественная оценка, нормализованная к
Эталонный ген Преимущество использования эталонного гена (такого как GAPDH, β-актин и др.) Скорее чем единица массы в качестве нормализатора является то, что этот метод обходит необходимость точное количественное определение и загрузка исходного материала. Это особенно удобно при проведении экспериментов по относительной экспрессии генов, когда материал часто ограничен. Недостатком является то, что этот метод требует наличие известного эталонного гена или генов с постоянной экспрессией во всех образцы проверены и чья экспрессия не изменяется при обработке исследование. Идентификация такого эталонного гена не тривиальна, и в последнее время Было предложено, что в большинстве случаев использование нескольких эталонных генов может необходим для точного количественного определения (см. Vandesompele et al., Genome Biology 3, исследование 0034.1–0034.11, 2002, для подробного обсуждения). Как обсуждалось в предыдущем разделе, при сравнении нескольких образцов относительное количественное определение, один из образцов обычно выбирается в качестве калибратора, и экспрессия гена - мишени во всех других образцах является выражено как увеличить или уменьшить относительно калибратора. Обычно, необработанные или Исходный образец выбран в качестве калибратора. В случае примера p53, мы можем выбрать нормальные клетки яичников в качестве калибратора и раковых клетки яичников в качестве тестового образца. Определить относительное выражение цели ген в тестовом образце и образце калибратора, используя эталонный ген (ы) в качестве нормализатор, уровни экспрессии как целевого, так и эталонного генов необходимы определяется с помощью RT-КПЦР. Короче говоря, вам нужно определить значения C T, как показано в таблице 4.2. Таблица 4.2. Значения C T, необходимые для относительного количественного определения с эталонным геном как нормализатор. Тестовое задание Калибратор (кал) Целевой ген C T (цель, тест) C T (цель, кал) Эталонный ген C T (ссылка, тест) C T (ref, cal) После того, как значения C T измерены, различные методы могут быть использованы для определения уровень экспрессии целевого гена в тестируемом образце относительно калибратора образец. В следующих разделах мы представляем три метода относительного количественного определения
с использованием контрольного гена: 1) метод Ливака, также известный как метод 2 –∆∆C T, 2) метод ∆C T с использованием эталонного гена и 3) метод Pfaffl. Каждый метод имеет преимущества и недостатки, а также предположения, которые должны быть выполнены чтобы результаты анализа были действительными.
количественный анализ данных ПЦР относительная количественная оценка 4.2.3.1 Метод 2 - ∆∆ C T (Livak) Метод 2 –∆∆C T для анализа относительной экспрессии генов широко используется и прост выполнять. Этот метод предполагает, что и целевой, и эталонный гены усиливается с эффективностью около 100% и в пределах 5% друг от друга. Перед использованием метод 2 –∆∆C T, важно проверить допущения, определив Эффективность амплификации мишени и эталонных генов. Усиление Эффективность мишени и эталонного гена можно определить методом изложенные в разделе 1.1.3. После того, как вы установили, что целевой и эталонный гены имеют сходные и почти 100% эффективности, вы можете определить относительную разницу в Уровень экспрессии целевого гена в разных образцах, используя следующие шаги: Во-первых, нормализуйте C T гена-мишени по сравнению с эталонным (ref) геном, для обоих тестовый образец и калибратор образца: ∆C T (тест) = C T (цель, тест) - C T (ссылка, тест) ∆C T (калибратор) = C T (цель, калибратор) - C T (ссылка, калибратор) Во-вторых, нормализуйте ΔC T испытуемого образца до ΔC T калибратора: ∆∆C T = ∆C T (тест) - ∆C T (калибратор) Наконец, вычислите коэффициент выражения: 2 –∆∆C T = нормализованный коэффициент экспрессии Полученный результат представляет собой кратное увеличение (или уменьшение) целевого гена в тесте образец относительно калибратора образца и нормируется на выражение эталонный ген. Нормализация экспрессии целевого гена по сравнению с Эталонный ген компенсирует любую разницу в количестве образца ткани. Если мишень и эталонные гены не имеют одинаковой эффективности амплификации Вы можете либо оптимизировать, либо перепроектировать анализы, либо использовать метод Pfaffl.
описано в разделе 4.2.3.3. Если, с другой стороны, цель и ссылка гены имеют одинаковую эффективность амплификации, но эффективность не равна 2, можно использовать модифицированную форму метода 2 –∆∆C T, заменив 2 в уравнение по фактической эффективности усиления. Например, если усиление Эффективность как мишени, так и эталонного гена составляет 1,95, формула 1.95 –∆∆C T должен быть использован. © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 41
анализ данных КПЦР в реальном времени относительная количественная оценка © 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени 42 Следующий гипотетический пример демонстрирует, как метод 2 –∆∆C T используется для определить относительную экспрессию целевого гена (р53) в раковой и нормальной клетки яичников. Пример: кДНК, представляющие 50 нг общей РНК, выделенной как из нормальной, так и из Опухолевые клетки яичника анализировали на p53 (целевой ген) и GAPDH (ссылка ген) сообщение. GAPDH может служить эталонным геном для этого исследования, потому что предыдущие исследования показали, что экспрессия GAPDH не изменяется между нормальными и опухолевые клетки. Значения C T для каждого образца приведены ниже: Образец C T p53 (цель) C T GAPDH (ссылка) Нормальный (калибратор) 15,0 16,5 Опухоль (тест) 12,0 15,9 Чтобы вычислить относительное выражение, используя шаги, описанные выше, С Т из целевой ген нормализован по отношению к C T эталонного гена для обоих тестируемых образцов и образец калибратора: ∆C T (в норме) = 15,0 - 16,5 = –1,5 ∆C T (опухоль) = 12,0 - 15,9 = –3,9 Во-вторых, ∆C T испытуемого образца нормируется на ∆C T калибратора: ∆∆C T = ∆CT (опухоль) - ∆CT (нормальное состояние) = –3,9 - (–1,5) = –2,4 Наконец, коэффициент выражения вычисляется: 2 –∆∆C T = 2 - (- 2,4) = 5,3 Опухолевые клетки экспрессируют р53 в 5,3 раза выше, чем нормальные клетки. 4.2.3.2 Δ С T
|
||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2021-04-12; просмотров: 102; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.188.142.69 (0.014 с.) |