Сравнить окраску и сделать вывод о содержании гликогена в печени голодного и сытого животного, объяснить полученный результат.
Работа № 2. Фосфоролиз гликогена и открытие фосфорной кислоты.
Ход работы:
1. Извлечение активного фермента - гликогенфосфорилазы.
0,5 г сырой печени поместить в ступку, добавить 4 мл фосфатного буфера и 4 мл р-ра NaF (для предотвращения утилизации Гл1ф), растереть пестиком до гомогенного состояния, при этом фермент перейдет в раствор.
Проведение фосфоролиза.
В две чистые пробирки поместить по 2 мл гомогената, содержащего активный фермент. В первую пробирку (опыт) добавить 2 мл фильтрата или раствора гликогена, во вторую пробирку (контроль) добавлять ничего не нужно.
Обе пробирки термостатировать в течение 40 минут при температуре 39 градусов. В это время в опытной пробирке идет фосфоролиз с использованием фосфорной кислоты, а в контрольной нет, так как она не содержит субстрата – гликогена.
По истечении инкубационного времени в контрольную пробирку внести 2 мл р-ра гликогена и в обе пробирки по 2 мл 20% раствора ТХУ к-ты. Все оставить на 5 мин.
при комнатной температуре для денатурации белков и остановки реакций. Растворы обеих пробирок отфильтровать в чистые пробирки с последующим проведением в них цветной реакции на фосфорную кислоту, по приведенному ниже (табл. 2) составу реакционной смеси.
Таблица 2. Состав реакционных смесей
| Реагенты (мл). | ||
Пробирки.
Через 2 минут инкубации при комнатной температуре сравнить интенсивность окраски в опыте и контроле, сделать вывод о наличие функционирующего фермента, указать значение для организма фосфоролиза.
ЛЕКЦИЯ № 1
|
| Поделиться: |
