Методы секвенирования нуклеиновых кислот

2.1. Метод химической деградации (Максама-Гилберта)

Метод определения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах (НК), основанный на нуклеотид-специфической химической деградации при обработке ДНК различными химическими агентами был предложен в середине 70-х годов ХХ века исследователями гарвардского университета (США) Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом. Данный метод был первым из подходов, предложенных для анализа нуклеотидных последовательностей. На первом этапе образец ДНК, обычно представляющий собой сравнительно короткий (100 - 1000 п.н.) гомогенный фрагмент, полученный, например, вырезанием полосы из геля после электрофоретического разделения образца ДНК, подвергнутого фрагментации с помощью эндонуклеаз, с одного из концов метят радиоактивной меткой. Затем образец разделяют на 4 части, после чего каждую из частей обрабатывают своим реагентом, приводящим к гидролизу ДНК по определенным основаниям (или по сочетаниям оснований). Параметры каждой реакции подбирают таким образом, чтобы гидролиз проходил не полностью, а лишь по некоторым позициям в каждой молекуле ДНК (в среднем, желательно получить одну модификацию на отдельную молекулу). В результате получают набор расщепленных фрагментов ДНК, соответствующих по длине местам нахождения нуклеотидов данного типа (Рис. 18).

 

Рис. 18 Принцип метода Максама-Гилберта

Расщепление одинаковых, помеченных с одного из концов, фрагментов ДНК по разным позициям дает фрагменты разной длины, затем фрагменты могут быть разделены с помощью электрофореза

Например, реакция определения положения гуанина выглядит так: при помощи диметилсульфата проводят метилирование ДНК, в результате которого гуанин метилируется по положению 3, а аденин - по положению 7. Дальнейшая обработка соляной кислотой при 0°С приводит к выпадению из цепи метиладенина (апуринизация по остаткам аденина). Такую ДНК с "пустыми" остатками дезоксирибозы в позициях, где был аденин, можно гидролизовать при нагревании в щелочи. Гидролиз в случае с метилгуанином осуществляется при помощи пиперидина. Модификации по пиримидиновым основаниям (C и Т) проводят с гидразином. Если реакцию проводить в присутствии NaCl, модификация затронет только C. Гидролиз обработанной гидразином ДНК проводят пиперидином.

После обработки, все четыре образца наносят на параллельные дорожки денатурирующего полиакриламидного геля (ПААГ), и проводят электрофорез таким образом, чтобы получить разделение фрагментов, отличающихся на один нуклеотид. Далее с помощью рентгеновской пленки получают электрофореграмму, по которой можно восстановить последовательность нуклеотидов, исследуемого фрагмента ДНК, отсчитывая, в какой из 4-х дорожек оказался фрагмент, следующий за самым легким продуктом, т.е. обладающим наибольшей электрофоретической подвижностью. Таким способом удается определить последовательность до 200 нуклеотидов за одно прочтение.

В настоящее время метод Максама-Гилберта почти не используется в виду сложности пробоподготовки и необходимости работы с вредными реактивами. В основе большинства используемых на сегодняшний день методов секвинирования ДНК лежит метод терминаторов (метод Сэнгера). Тем не менее, метод Максама-Гилберта имеет ряд неоспоримых преимуществ, главными из которых являются его полная независимость от вторичных структур и отсутствие необходимости знания участка последовательности, интересующей исследователя ДНК. В связи с этим, до последнего времени, метод Максама-Гилберта использовался в случаях, когда фермент ДНК-полимераза не мог пройти через вторичную структуру в исследуемом образце ДНК, например через псевдоузел.