Простая радиальная иммунодиффузия

 

На плоской поверхности создают равномерный слой геля, содержащего антисыворотку. Из лунок, проштампованных в геле и заполненных раствором антигена, молекулы АГ диффундируют в гель и образуют кольца преципитации с соответствующими AT. Диаметр колец преципитации увеличивается до тех пор, пока не истощится раствор антигена. Этот метод впервые описал Манчини (Mancini) в 1963 г. Известны многочисленные модификации этого метода, мы приводим описание, основанное на методике, изложенной в монографии Mayer и Walker.

 

Материалы и оборудование. Для работы необходимы моноспецифические антисыворотка, стандартные препараты, контрольные сыворотки, буферные растворы, агар, рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, измерительное устройство с точностью до 0,1 мм, микро-шприцы для внесения объемов 1—10 мкл.

 

Последовательность этапов исследования. Растворяют 1,5 г агара в 100 мл буфера на водяной бане, охлаждают до 48 °С и смешивают с антисывороткой, желательно подогретой до той же температуры, в небольшой пропорции. Наносят пипеткой 2 мл смеси на предметное стекло, установленное строго горизонтально на подставке, нагретой до 35—40 °С. Золь агара, содержащий антитело, распределяется по поверхности предметного стекла и застывает слоем толщиной приблизительно 1 мм. Рекомендуют также наносить на предметные стекла по 1 мл горячего раствора агара (10 г/л) и высушивать их при 70 °С перед использованием. Если пластины для простой радиальной иммунодиффузии будут храниться перед употреблением в течение 2—3 недели (во влажной камере при 4°С), то к гелю добавляют консерванты (мертиолят, 0,1 г/л, азид натрия, 0,2 г/л). На предметном стекле в слое геля вырезают по 8 лунок при помощи отшлифованной стеклянной трубки, соединенной с водоструйным насосом (таким образом создают пониженное давление). В каждую из лунок вносят по 2 мкл раствора антигена. Реакцию простой радиальной иммунодиффузия проводят во влажной камере. Если линии преципитации достаточно выражены, оценку результатов можно проводить прямо на влажной пластинке. В тех случаях, когда оценку проводят немедленно, пластинки с гелем отмывают 2—3 раза в 0,15 М NaCl; каждая отмывка длится 12 часов. Этим достигается удаление непреципитировавших белков. После отмывки препараты высушивают и окрашивают, например, амидочерным 10 В. Последовательность операций представлена на рисунке:

 

Простая радиальная иммунодиффузия. Этапы работы

 

 

Калибровочная кривая

 

К моменту завершения диффузии наблюдается прямая линейная зависимость между исходной концентрацией антигена и площадью преципитата. Это можно видеть на примере графика определения IgA:

 

Простая радиальная иммунодиффузия. Кривая для определения IgA

 

 

D2 — квадрат диаметра диффузии

 

Снижая уровень антисыворотки в геле, можно последовательно увеличивать диаметр зоны преципитации. При этом К возрастает и увеличивается экономичность концентрации реагентов возможно только до определенных пределов, так как может возникнуть ослабление преципитации. В каждом отдельном случае концентрацию антисыворотки в геле подбирают в зависимости от титра антител. Обычно рекомендуют использовать 1—5% антисыворотки.