Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Ингибиторный иммуноферментный анализ
В ингибиторном ИФА (рис. 4.6) на твердой фазе иммобилизуют антиген. Растворимые антитела как реагент конъюгированы с ферментом. Определяемый антиген в испытуемой пробе конкурирует с иммобилизованным на твердой фазе антигеном за растворимые антитела. В итоге ферментативная активность, измеряемая на твердой фазе, обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе. Результаты ИФА показаны на рис. 4.7 (см. также цв. вклейку). Рис. 4.5. Схема постановки прямого метода ИФА: а - для выявления антител; б - для выявления антигена; АГ - антигены; АТ - антитела. «Сэндвич»-ИФА «Сэндвич»-ИФА (рис. 4.8) разработан для антигенов, на которых есть не менее двух неперекрывающихся эпитопов. Против обоих эпитопов получают в качестве реагентов специфичные антитела. Антитела к одному из эпитопов сорбируют на твердой фазе. Испытуемую пробу добавляют к твердой фазе, инкубируют, отмывают. После отмывки вносят конъюгат антител ко второму эпитопу с ферментом. Ферментативная активность, остающаяся на твердой фазе, прямо пропорциональна содержанию антигена в пробе. «Сэндвич»-ИФА не требует препаратов очищенных антигенов, что выгодно отличает его от конкурентных и ингибиторных методик, поскольку чистые антигены всегда труднодоступны и дороги. Чувствительность «сэндвич»-ИФА потенциально выше, чем конку- Рис. 4.6. Принцип конкурентного (а) и ингибиторного (б) ИФА Рис. 4.7. Планшет с результатами ИФА рентных и ингибиторных. Аналогичная технология применима и с использованием одного антитела (и на твердой фазе, и в составе конъюгата с ферментом) в случаях наличия на заданном антигене повторяющихся эпитопов. В современных модификациях ту же технологию называют ловушечным ИФА (capture IA) - антитела на твердой фазе «ловят» свой антиген из смеси веществ в биопробе. Рис. 4.8. Принцип «сэндвич»-ИФА Иммунометрический анализ При иммунометрическом анализе (рис. 4.9) в пробирку с испытуемой пробой, предположительно содержащей определяемый антиген, вносят заведомый избыток меченых антител. Затем к этой смеси добавляют также заведомый избыток иммобилизованного на мелкодисперсной твердой фазе антигена. После инкубации центрифугированием отделяют растворимую фракцию (супернатант) и в ней измеряют ферментативную активность (если метка - фермент).
Ферментативная активность супернатанта прямо пропорциональна содержанию антигена в испытуемой биопробе. Благодаря использованию избытка реагентов этот метод более чувствителен, чем конкурентный ИФА, и его аналитические возможности приближаются к предельным. Рис. 4.9. Принцип иммунометрических анализов: 1 - пробирка с биопробой (сывороткой крови или др.); 2 - в пробирку с биопробой вносят заведомый избыток чистого антигена, сорбированного на мелкодисперсном твердофазном носителе; 3 - затем в ту же пробирку вносят заведомый избыток меченых антител; 4 - материал инкубируют (чтобы реагенты успели связаться), центрифугируют и в супернатанте измеряют количество метки. Величина сигнала в супернатанте прямо пропорциональна содержанию искомого вещества (антигена) в испытуемой пробе. OD - optical density - величина оптической плотности, измеренная спектрофотометром; АГ - концентрация искомого антигена в биопробах Непрямые иммуноанализы Непрямые методики (рис. 4.10) применяют чаще, чем прямые. Непрямым иммуноанализом называют анализ, в котором метку присоединяют не к целевому антигену и не к антителу против целевого антигена, а к так называемым вторым антителам - антивидовым антииммуноглобулиновым антителам, т.е. антителам к иммуноглобулинам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают. Рис. 4.10. Принцип непрямых иммуноанализов Таким образом, один и тот же препарат конъюгата антиглобулиновых антител с ферментом используют в качестве проявляющего стандартного реагента в разных тест-системах для определения различных конкретных антигенов или антител. Вместо антивидовых антиглобулиновых антител для конъюгации с ферментом может быть использован, например, протеин А стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью связывается с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включая человека. Все описанные схемы постановки прямого варианта ИФА (конкурентный, ингибиторный, «сэндвич», иммунометрический) применяют и в непрямом варианте.
Непрямые варианты ИФА не требуют очистки искомых антигенов или антител. Чистым должен быть только препарат антивидовых антииммуноглобулиновых антител. В качестве ферментов-меток в ИФА используются следующие ферменты и субстраты для них. 1. Пероксидаза из корней хрена, субстраты: • орто-фенилендиамин (продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм); • 3,3'-диаминобензидин (продукт коричневый, нерастворимый); • 3-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый); • 5-аминосалициловая кислота (продукт коричневый, растворимый, поглощает при 405 нм); • 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота (продукт зеленый, растворимый, поглощает при 405 нм); • 4-хлоро-1-нафтол(продуктголубой,нерастворим);3,3'-диметокси- бензидин (продукт желто-оранжевый, растворимый, поглощает при 405 нм); • 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (продукт голубой, растворимый, поглощает при 450 нм); • ABTS - 2,2'-азино-ди(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота. 2. β-Галактозидаза (субстраты - дериваты β-галактозида, например 4-метилумбелиферил-β-D-галактозин). 3. Щелочная фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм). 4. У реаза (субстрат - мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуется очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм). Нерастворимые продукты ферментативных реакций используют в методах иммуногистохимии и иммуноблота, растворимые - в иммуноферментных анализах, в которых результат регистрируют количественно спектрофотометрически. Встречаются оригинальные разработки с использованием других (кроме вышеперечисленных) ферментов-меток. Если по тем или иным биохимическим причинам заданный антиген или интересующее антитело не удается конъюгировать с меткой без существенных потерь в аффинности их связывания, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты. Например, нередко используют так называемое «авидинбиотиновое» взаимодействие. Авидин - белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, биотин - витамин Н (он же кофермент R). Авидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd ~ 10-15 M) связывает биотин. Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином. Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела (существуют коммерческие препараты). Соответственно все эти дополнительные компоненты используют при необходимости в конструкциях тест-систем, предназначенных для детекции того или иного заданного вещества. Сходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выделяемый из грибов Streptomyces avidinii. В конкретных вариантах тест-систем используют разные буферные растворы, соответствующие свойствам конкретных антигенов, ферментов и их субстратов. Для примера мы опишем последовательность действий и используемые реагенты при выполнении непрямого твердофазного иммуноанализа, его простой и часто встречающийся вариант, подходящий, в частности, для определения специфических противовирусных антител как маркера наличия в организме той или иной вирусной инфекции (специфическую лабораторную диагностику вирусных инфекций применяют для выявления инфицированности ВИЧ, вирусами гепатитов, герпеса, цитомегаловирусами и др.). Лабораторная работа 4-2
|
||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-02-10; просмотров: 637; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.116.37.129 (0.011 с.) |