Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК

Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК, таких как выделение, рестрикция, ПЦР, молекулярное клонирование, наиболее часто используют электрофорез.

Электрофорез – метод разделения макромолекул (в том числе молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза – горизонтальный и вертикальный.

 

 

Рис. 1. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле.

Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя, например бромида этидия.

Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода к аноду. На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов. Агарозный гель – пористая структура, и увеличение концентрации агарозы в геле приводит к уменьшению размеров его пор и, соответственно, к снижению скорости движения макромолекул сквозь гель. Увеличение напряженности электрического поля ускоряет движение молекул. Заряд молекулы увеличивается пропорционально ее длине, но при этом пропорционально длине увеличивается и ее масса. Поэтому ключевым фактором, определяющим скорость движения молекул в геле является способность молекул «протискиваться» через поры геля. Разделение молекул основано на том, что электрофоретическая подвижность молекулы ДНК снижается с увеличением ее длины. Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с одинаковой скоростью. Подвижность суперспирализованных и просто кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера.

При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в один из карманов геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с известными значениями молекулярных масс – как правило, это ДНК известной плазмиды или фага, порезанная определенной рестриктазой, но это могут быть и искусственно синтезированные фрагменты).

Рис. 2. Один из стандартных маркеров молекулярного веса (плазмида pR322, рестриктаза BsuR I).

Рис. 3 Электрофоретический гель, окрашенный бромидом этидия. На левой дорожке нанесен маркер молекулярного веса

 

Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например, бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.

Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в двуцепочечные молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания электрофореза гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254-400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра, при этом становится видна ДНК.

Для вертикального гель-электрофореза используют полиакриламидный гель (ПААГ). Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.

Рестрикционный анализ

Рестрикция – процесс расщепления чужеродной молекулы ДНК под действием специфических бактериальных ферментов – эндонуклеаз рестрикции или рестриктаз.

Эндонуклеазы рестрикции - это бактериальные ферменты, которые расщепляют молекулы ДНК внутри участков с определенной последовательностью. Фермент расщепляет обе цепи ДНК, причем одноцепочечные разрывы могут располагаться точно друг против друга (образуются «тупые» концы) или с некоторым смещением друг относительно друг друга (образуются «липкие концы»).

Рис. 4. «липкие концы», образующиеся в результате гидролиза ДНК рестриктазами BamH I и Pst I.

Эндонуклеазы рестрикции являются незаменимым инструментом молекулярного биолога, поскольку позволяют делить большие молекулы ДНК на заранее известные фрагменты