Качественные реакции на витамин A

 

Материалы, посуда, реактивы:

33% раствор треххлористой сурьмы в хлороформе (хранят в склянке из темного стекла, пригоден к употреблению через 6-8 часов после приготовления; срок годности – две недели);

концентриро­ванная серная кислота;

ледяная уксусная кислота, насыщенная сульфатом железа (II);

уксусный ангидрид;

рыбий жир, медицинский; употреб­ляют только свежий препарат, т.к. старый или прокипяченный рыбий жир практически лишены витамина А;или масляный раствор витамина А;

серная кислота, концентрированная (r ₂₀= 1,836);

хлороформ;

пипетки;

сухие пробирки.

А) Реакция с треххлористой сурьмой.

В сухую пробирку вносят 2-3 капли свежего рыбьего жира или масляного рас­твора витамина А и добавляют 1 мл раствора треххлористой сурьмы в хлороформе, перемешивают. Появляется синее ок­рашивание. В связи с тем, что развитию окраски мешает при­сутствие воды, рекомендуется в реакционную смесь доба­вить несколько капель уксусного ангидрида.

 

Б) Реакция с сульфатом железа.

В пробирку вносят 1-2 капли рыбьего жира или масляного раствора витамина А, добавляют 5-10 капель ледяной уксусной кислоты, насы­щенной сульфатом железа. Появляется голубое окрашивание, переходящее в розово-красное.

В) Реакция с серной кислотой.

Под воздей­ствием концентрированной серной кислоты растворы ви­тамина А приобретают сине-фиолетовую окраску, возник­новение которой связано с водоотнимающим действием реактива. Окраска является нестойкой и быстро сменяет­ся буроватой, вследствие образования липохрома.

1 каплю рыбьего жира растворяют в 20-25 каплях хлороформа, к раствору добавляют 1 каплю концентри­рованной серной кислоты и встряхивают. Появляется сине-фиолетовое окрашивание, которое вскоре переходит в красновато-бурое и бурое.

Лабораторная работа № 2

Определение содержания каротинов

В растительных объектах

 

Каротины экстра­гируют ацетоном или этиловым спиртом и выделяют из смеси пигментов на хроматографической бумаге. Кароти­ны элюируют из хроматограммы петролейным эфиром или низкокипящим бензином и их содержание определя­ют путем колориметрирования.

 

Материалы, посуда, реактивы:

петролейный эфир (температура кипения 60-70° С) или бензин (тем­пература кипения 70-80° С);

ацетон или этиловый спирт, 95-96%;

хроматографическая бумага (вес 1 дм ² = 0,85 г);

углекислый натрий или углекислый кальций;

азобензол, перекристаллизо­ванный из спирта и высушенный. 145 мг препарата рас­творяют в 100 мл 96% этилового спирта; из данного основного раствора готовят рабо­чий, разбавляя его спиртом в 10 раз (в мерной колбе на 100 мл). 1 мл рабочего раствора азобензола соответствует 0,00235 мг каротина; растворы хранят в темном месте;

кварцевый песок;

концентрационный ко­лориметр или колориметр-нефелометр;

стеклянные со­суды цилиндрической формы, высота 25-30 см, диаметр 13-15 см, с притертыми пробками или крышками;

ступки фарфоровые;

мерные цилиндры на 100 мл с притертыми пробками.

А) Экстракция каротинов

Навеску растительного материала(1-10 г в зависи­мости от предполагаемого содержания каротинов) рас­тирают в ступке с ацетоном или 95-96% спиртом, добавив немного кварцевого песка и ще­потку углекислого натрия или химически чистого мела (углекислого кальция) для нейтрализации кислот. Аце­тон или спирт приливают порциями по 10-15 мл. Экстрагирование повторяют несколько раз. Вы­тяжки сливают в мерный цилиндр на 100 мл. Извлечение продолжают до получения бесцветного экстракта. Раст­вор в мерном цилиндре доводят ацетоном или спиртом до определенного объема (50-60-75-100 мл).

 

Б) Определение каротинов

Хроматографическую бумагу нарезают на полоски длиной 25 см и шириной 15 см. 0,5-1 мл ацетонового (или спиртового) раствора пиг­ментов наносят (в виде полосы) на полоску хроматографической бумаги на расстоянии 4 см от ее нижнего края. Бумагу подсушивают на воздухе (лучше всего с помощью фена) в затененном месте и затем сворачивают в однослойную трубку, верхний конец которой сшивают или скрепляют пластмассовой скрепкой. Трубку ставят на дно стеклянного сосуда, куда заранее был налит петролейный эфир или низкокипящий бензин слоем в 2-3 см (он дол­жен быть ниже места нанесения раствора пигментов на бумагу). Через 20-30 мин. бумажную трубку вынимают из сосуда. Вырезают полоску бумаги, окрашенную в жел­то-оранжевый цвет (она находится сразу же за фронтом подъема растворителя), измельчают ее (нарезают) в стеклянный бюкс или стаканчик и извлекают каротины небольшими порциями (по 1-2 мл) петролейного эфира или бензина, повторяя экстрагирование до получения бесцветного раствора. Раствор каротинов доводят этими же растворителями до определенного объема (например, 10-20 мл) и колориметрируют, употребляя в качестве стандартного рабочий раствор азобензола (14,5 мг в 100 мл). Содержание каротина (в миллиграммах на 100 г продукта) Х рассчитывают по формуле:

 

где V₁ — объем ацетонового (спиртового) экстракта пигментов в мерном цилиндре, мл;

V₂ — объем ацетоно­вого (спиртового) экстракта, нанесенный на бума­гу, мл;

V₃ — объем раствора каротинов в петролейном эфире или бензине, взятый для колориметрирования, мл;

D₁ — показания шкалы колориметра для стан­дартного раствора;

D₂ — показания шкалы колориметра для исследуемого раствора (среднее из 3-4 определе­ний);

n — навеска растительного материала, г.

 

При колориметрировании каротинов пользуются си­ним светофильтром.

Лабораторная работа № 3

Спектрофотометрический метод определения

содер­жания ретинола в рыбьем жире

 

Материалы, посуда, реактивы:

рыбий жир (медицинский);

едкое кали, 50% водный раствор;

этиловый спирт, 95%, не содержащий альдегидов. Для проверки на альдегиды к 10 мл спирта добавляют 10 мл воды, 1 мл 2 % раствора азотнокислого сереб­ра и (по каплям) раствор аммиака до исчезновения обра­зующегося вначале осадка; смесь ставят в темное место на 12 часов; она должна оставаться бесцветной и про­зрачной;

этиловый спирт абсолютный, 99,8% (по объему). Для получения его к 95% спирту-ректифи­кату прибавляют негашеную известь в таком количестве, чтобы куски ее выступали над поверхностью жидкости в колбе. Соединяют колбу с обратным холодильником, снабженным хлоркальциевой трубкой с негашеной из­вестью, осторожно нагревают на водяной бане (при тем­пературе не выше 75° С) в течение часа и затем остав­ляют стоять на два дня. Через два дня отгоняют спирт в колбу Бунзена, которую плотно соединяют с холодиль­ником. Отводную трубку колбы соединяют с хлоркаль­циевой трубкой. Концентрация такого спирта составляет около 99,5%. Для более полного удаления влаги к 99,5% спирту добавляют твердый едкий натр или едкое кали (10 г на 1 л) и перегоняют, отбрасывая начальную и конечную фракции;

диэтиловый эфир;

сернокислый натрий, прокаленный, сохраняют в сосу­де с притертой пробкой;

спект­рофотометр;

делительные воронки;

колбы конические емкостью 100 мл;

колбы для от­гонки;

баня водяная;

баллон с азотом.

Ход работы:

В конической колбе емкостью 100 мл отвешивают на аналитических весах около 1 г жира, прибавляют 30 мл этилового спирта, не содержащего альдегидов, и 3 мл 50% раствора едкого кали. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и ставят на 30 мин. в горячую водяную баню (85-90° С). После омыления колбу ох­лаждают, добавляют 50 мл воды и содержимое переносят в делительную воронку. Неомыляемую фракцию три раза экстрагируют диэтиловым эфиром, при этом первый раз берут 50 мл его, а во второй и третий – по 30 мл. Все эфирные вытяжки сливают в другую делительную ворон­ку и несколько раз промывают водой до полного удале­ния остатков щелочи (проба с фенолфталеином). Для обезвоживания к промытой эфирной вытяжке добавляют 8 г прокаленного сернокислого натра и ставят на 30 мин. в темное место, время от времени встряхивая, после чего фильтруют через сухой бумажный фильтр в колбу для перегонки. Сернокислый натрий на фильтре несколько раз промывают диэтиловым эфиром (берут каждый раз по 10 мл), который фильтруют в ту же колбу. Эфир от­гоняют на водяной бане при температуре до 40° С (если отгонку ведут в токе азота, температуру бани можно по­высить до 47-50° С).

Примечание. Отгонку эфира рекомендуется вести в токе азота, учитывая легкую окисляемость ретинола; в студенческой работе, рассчитанной на ознакомление с методом, отгонку допускается проводить на воздухе (под тягой!), соблюдая противопожарные ме­роприятия.

После отгонки эфира неомыляемый остаток раство­ряют в абсолютном этиловом спирте до получения рас­твора, содержащего в 1 мл 8 международных единиц (ME) витамина А (при изготовлении раствора учитыва­ют, что в 1 г невитаминизированного рыбьего жира дол­жно содержаться не менее 350 ME витамина А; в 1 г ви­таминизированного рыбьего жира содержится 1000 ME ретинола). Изменяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длинах волн 311, 324,5 и 334 нм.

Содержание витамина А в международных единицах х в 1 г жира вычисляют по формуле:

,

где D _испр = 7 D _324,5 – 2,912 D ₃₁₁ – 4,088 D ₃₃₄ ;

D _324,5, D ₃₁₁, D ₃₃₄– оптические плотности раствора при длинах волн 324,5, 311 и 334 нм соответственно;

V — разведе­ние, мл;

Q — навеска жира, г;

1850 — коэффициент пере­вода в международные единицы.

Одна международная единица витамина А равна 0,3 мкг.

Лабораторная работа № 4