Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Методы, применяемые в иммунодиагностике
Тесты первого порядка – для определения группы диагнозов. Тесты 2, 3 и т.д. порядков – для уточнения диагноза. Двойная радиальная иммунодиффузия - полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними. Суть метода заключается в следующем: - в лунки, вырезанные в агаре, вносят исследуемую смесь антигенов и антитела с известной специфичностью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в расположенные вокруг нее - антигены); - антигены и антитела диффундируют по направлению друг к другу; - в том месте, где произошло связывание антител и антигенов, образуются полосы преципитации. По взаимному расположению и форме полос преципитации можно оценить степень сходства между антигенами, находящимися в соседних лунках. В настоящее время этот метод применяется в диагностике аутоиммунных заболеваний для выявления аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам. Хотя по чувствительности метод двойной радиальной иммунодиффузии уступает многим количественным методам, технически он прост, не требует высокоочищенных антител, специфичен и может использоваться при проведении массовых исследований. Простая радиальная иммунодиффузия позволяет количественно определить содержание антигена в исследуемой пробе. Суть метода заключается в следующем. В слое агара, содержащего антитела, вырезают лунки, в одни из которых вносят исследуемый антиген, в другие - стандартный. Антигены диффундируют из лунок в агар, образуя радиальные зоны преципитации. Диаметр зоны преципитации пропорционален концентрации антигена. Это простой и надежный метод количественной оценки иммуноглобулинов (включая подклассы IgG), компонентов комплемента (например, СЗ, С4, фактора В) и других белков сыворотки. Существуют готовые наборы, позволяющие определить антиген в низкой концентрации - не более 3 мкг/мл. Определяя содержание иммуноглобулинов, необходимо учитывать, что изменение их свойств может искажать результаты исследования. Так, если в сыворотке содержатся мономерные IgM (например, при макроглобулинемии Вальденстрема, атаксии-телеангиэктазии), уровень IgM будет искусственно завышен, поскольку мономерный IgM диффундирует быстрее, чем пентамерный. Присутствие ревматоидного фактора в исследуемой пробе, напротив, искусственно снижает уровень IgG, поскольку иммунные комплексы, состоящие из IgG и ревматоидного фактора, диффундируют медленнее, чем несвязанный IgG. Сыворотка многих больных с дефицитом IgA содержит антитела к белкам животного происхождения, например к козьим иммуноглобулинам, поэтому при использовании козьих антител для определения уровня IgA в этом случае получаются завышенные результаты.
Твердофазный иммуноферментный анализ применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с радиоиммунным анализом, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофазпый иммуноферментный анализ в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG). Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: - смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; - мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного иммуноферментного анализа при диагностике ВИЧ- инфекции. Непрямая иммунофлюоресценция - метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.
Гемагглютинация применяется для выявления антител к тиреоглобулину и микросомальным антителам, латекс-агглютинация - для выявления ревматоидного фактора и некоторых других антител. Эти методы просты и позволяют количественно определить антиген, однако менее чувствительны, чем радиоимунный и твердофазный иммуноферментный анализы. Определение общего уровня IgE обычно проводят с помощью радиоиммунного анализа, поскольку низкое содержание этого иммуноглобулина не позволяет использовать те методы, которые применяются для определения IgG, IgA и IgM. Количественную оценку IgE проводят таким образом: - исследованную пробу добавляют к сорбированным на твердой подложке антителам против IgE; - после отмывания от несвязанного IgE добавляют меченные изотопом антитела к IgE; - после отмывания от несвязанных антител по уровню радиоактивности определяют количество IgE в исследуемой пробе. Определение специфических IgE обычно проводят с помощью кожных проб. Определение специальных IgE с помощью радиоаллергосорбенного теста показано при высоком риске анафилактических реакций, пораженной кожи и проведения лечения, влияющего на результаты кожных проб. Суть метода заключается в следующем: - к аллергену, сорбированному на твердой подложке, добавляют исследованную сыворотку; - после отмывания не связавшихся IgE добавляют меченые тела к IgE; - по уровню радиоактивности определяют содержание специфических IgE в исследованной пробе. Применяется модификация метода с использованием меченых ферментов антител к IgE. Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками. Суть методов заключается в следующем: - к тучным клеткам, покрытым специфическим IgE, добавляют антиген; - связывание антигена с IgE вызывает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение гистамина; - определяют содержание гистамина в растворе. Одной из разновидностей реакций гемагглютинации является реакция Кумбса, применяемая для выявления неполных антител. Как уже упоминалось ранее, такие антитела закрепляются на поверхности эритроцитов естественным образом, поэтому если смешать суспензию эритроцитов с антителами, комплементарными изотипическим антигенным детерминантам иммуноглобулинов определенного класса (антииммуноглобулинами), будет происходить их агрегирование. Такой вариант реакции Кумбса называется прямым и применяется для выявления уже сорбированных неполных антител. Для выявления неполных антител в плазме крови смешивают взятую от пациента сыворотку и суспензию эритроцитов другого организма, выдерживают необходимое для адсорбции неполных антител время и добавляют антииммуноглобулины. Такой тест называется непрямой реакцией Кумбса. Реакции выявления неполных антител проводят при ряде неинфекционных (гемолитическая анемия, желтуха новорожденных и др.) заболеваний и некоторых инфекционных (бруцеллезе, туляремии и др.) болезнях. Примером реакции, в которой используются комплемент и эритроциты, является реакция связывания комплемента (сокращенно РСК). Наибольшую известность получило применение этой реакции в диагностике сифилиса, поскольку выявлять образующиеся в малых количествах в организме болеющих антитела против возбудителя этой болезни методами преципитации или агглютинации не удавалось. В настоящее время существует еще несколько серологических методов диагностики сифилиса, но РСК не утратила своего значения до сих пор. Для постановки этой реакции принято готовить две системы. Система I представляет смесь диагностикума, содержащего антигены Treponema pallidum (возбудителя сифилиса), прогретой до 57˚С в течение 30 мин исследуемой сыворотки (прогревание необходимо для инактивации комплемента человека в сыворотке) и раствор комплемента (чаще всего морской свинки) в строго определенном количестве (так называемый оттитрованный комплемент). Параллельно готовят систему II (гемолитическую систему), которая содержит 3 % взвесь отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана и сыворотку кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Все компоненты обоих систем, кроме эритроцитов и анализируемой сыворотки, производятся промышленно и поставляются в лаборатории в лиофилизированном состоянии. Для проверки качества используемых растворов и условий проведения реакции каждый раз готовят контроли: 1) диагностикума – диагностикум + комплемент + физиологический раствор (вместо сыворотки), 2) комплемента – раствор комплемента + двойной объем физиологического раствора, 3) исследуемой сыворотки – сыворотка + комплемент + физиологический раствор (вместо диагностикума), 4) заведомо положительный контроль – стандартная иммунная сыворотка против антигенов Treponema pallidum + диагностикум + комплемент, 5) заведомо отрицательный – сыворотка здорового человека + диагностикум + комплемент. После инкубирования системы I, системы II и всех контролей в течение 45 мин при 37˚С во все пробирки доливают двойной объем системы II и продолжают инкубирование при этой же температуре до полного гемолиза в контрольных пробирках 1–4 (обычно 30–40 мин). Если в опытной пробирке имеет место гемолиз – раствор становится красным и прозрачным (так называемая «лаковая кровь»), результат реакции считается отрицательным. Если эритроциты не лизируются, а оседают на дно (раствор становится прозрачным, но бесцветным) – положительным. Суть такого прочтения результатов заключается в следующем. При наличии в исследуемой сыворотке антител к антигенам диагностикума активация комплемента происходит еще в первой системе, и он, будучи добавлен в ограниченном количестве, израсходуется. При отсутствии таких антител антиген сохраняется в исходном количестве и фактически переходит в систему II, где активируется на поверхности покрытых антителами кролика эритроцитов барана, что и приводит к их гемолизу и выходу гемоглобина в раствор.
|
|||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-02-07; просмотров: 303; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.116.51.117 (0.008 с.) |