Амплификация сигнала и неспецифическое связывание.

Метки сегодня:

• радиоизотопы;

• ферменты;

• флюорохромы;

• металлы и металлопротеины.

промежуточные связующие вещества

• биотин

• дигоксин

Ферменты, используемые в иммуногистохимических методиках, и соответствующие им субстраты

Пероксидаза хренаH2O2

Щелочная фосфатаза

Глюкозоксидаза

 

Флюоресцентные метки имеют свои недостатки:

- необходимость специального флюоресцентного микроскопа с набором барьерных фильтров;

- низкая чувствительность метода;

- сложность подготовки препаратов;

- быстрое затухание флюоресценции, даже при использовании реагентов, снижающих данный эффект (например, DAPI);

- полученные препараты нельзя хранить.

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 1
Прямой (А) и непрямой (Б) метод визуализации
результатов реакции «антиген-антитело»

Преимущества Б:

• вторичные антитела против Fc-фрагмента другого вида животного получать намного проще, также легче присоединить к ним метку;

• первичные антитела не несут на себе лишнего груза, а значит, легче и быстрее проникают в ткани, метка не влияет на конформационные изменения после взаимодействия антител с антигеном.

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 2
- системы с использованием антител против пероксидазы и щелочной фосфатазы (PAP и APAAP-комплексы).

 

1 этап: первичные антитела

2 этап: вторичные антитела против первичных (связующее антитело)

3 этап: вносятся антитела против пероксидазы или щелочной фосфатазы, полученные от животного того же вида, от которого получены первичные антитела, антигенсвязывающие участки которого заняты соответствующим ферментом.

Формируется комплекс, где с одним антигеном связываются уже 2 молекулы фермента

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 3
- метод непрямого иммуноокрашивания с использованием биотин-авидинового комплекса (1979)

Биотин

- является коферментом во многих реакциях присоединения (карбоксилирования).

- соединение, стойкое к действию высоких температур, к кислой и щелочной среде, хорошо растворяется в воде и спирте.

- легко может вступать в стойкое соединение с различными белками, в том числе с ферментами и иммуноглобулинами.

- содержится в большом количестве в белках птичьих яиц, где он связан с авидином

Авидин

• образует с биотином чрезвычайно стойкий комплекс: К(А)=10(15) моль(-1)

• гликопротеид с молекулярной массой 68 кДа

• имеет 4 места связывания, к которым можно присоединить биотин или белки

 

АВС метод
Недостатки авидин соединяется с эндогенным биотином, который в большом количестве содержится в печени и почках,

• авидин может соединяться с лектинами и заряженными группами в тканях, так как авидин имеет заряд (рI 10,0).

стрептавидин – белок с молекулярной массой около 60 кДа, который получают из микроорганизмов Streptomyces avidinii (SaBC-метод)

не имеет заряда в нейтральной среде, не связывается с эндогенным ферментами и намного меньше с эндогенным биотином. Замена авидина на стрептавидин позволила резко уменьшить фоновое окрашивание и повысить чувствительность метода приблизительно в 8 раз

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 4
применение полимерных систем

Основой систем является декстрановая молекула, на которой конъюгируют до 20 молекул первичных или вторичных антител и 100 молекул фермента

 

АМПЛИФИКАЦИЯ СИГНАЛА 5
системы, основанные на применении тирамида

 

Тирамид, предварительно связанный с биотином, под действием пероксидазы переходит в нерастворимую форму и оседает в ткани около фермента. Затем добавляют комплекс стрептавидин-пероксидаза, который присоединяется к тирамиду и усиливает ферментативную активность в месте связывания во много раз.

Первые три этапа такие же, как в ABC-методе. Последующие этапы:

А – в систему добавляют тирамид, связанный с биотином;

Б – под действием пероксидазы тирамид переходит в нерастворимую форму и оседает вокруг комплекса «антиген-антитело».

В – в систему добавляют комплекс стрептавидин-биотин-фермент, который связывается с биотином, связанным с тирамидом.

Неспецифическое связывание.

Способность антител дифференцировать антигены хорошо иллюстрируются различной реактивностью антител по отношению к близким по химической структуре гептенам. Антисыворотка, полученная к одному антигену, может перекрёстно реагировать с родственным антигеном, несущим одну или несколько идентичных или похожих детерминант. Речь идёт о поликлональных антителах. (если кто-то знает, что это не то, поправьте)

 

22 Система контролей: 1)позитивный,(как должно быть);

2)негативный (когда неспецифическое связывание,когда берем другое а/т вместо первого)

3) изотип контроль для иммуногистологии (каждый изотип имеет Fc – фрагмент). Например,береміммуноглобулін Gокрашиваем,идоказываем,что вторичное антитело не распознают любую часть молекулы.

Контроли нужны всегда. Нужно контролировать бэкграунд. Если сэндвич м.б.ошибки: плохой а/г, первичное а/т. Иммунофлюорография: негат, изотип-контроль – произаодят а/т, которые не к чему не направлены: 1 препарат – специфические а/т, 2 препарат – изотип контроль(если окрашивание, то бэкграунд).