К практическому занятию № 46

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 46

ТЕМА: «Микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых гемофилами».

I План занятия

1. Закрепить знания по изучению таксономии, морфологии, методов лабораторной диагностики гемофилов.

2. Изучить правила забора, хранение и транспортировки биологического материала приинфекциях, вызываемых гемофилами.

4. Овладеть методикой и техникой бактериоскопического и бактериологического методов диагностики гемофилов.

5. Изучить методики и провести постановку тестов идентификации гемофилов.

6.Изучить экспресс – методы обнаружения капсульного антигена (латекс-агглютинация, коагглютинация со стафилококковым протеином А, реакция встречного иммуноэлектрофореза).

II Самостоятельная работа

Задание 1

Познакомьтесь с нормативной документацией, регламентирующей микробиологическую диагностику гемофилов:

1. Микробиологические методы исследования биологического материала. Инструкция от 13.03.2010г. Р № 075-0210.

2. Временные методические рекомендации по забору и транспортировке биологического материала на гемофильную инфекцию № 02 -19/ 1638 от 21.06.2007г., ГУ «ГОЦГЭ и ОЗ», Шерендо Я.М.

3. Приказ № 68/ 14-с от 13.02.2007г «О формировании системы эпидемиологического надзора за гемофильной инфекцией».

Задание 2

Изучите правила забора, хранения и транспортировки исследуемого материала – кровь, спинномозговая жидкость, мокрота - по рекомендациям по забору материала на гемофильную инфекцию ГУ «ГОЦГЭ и ОЗ», Гродно, 2007(см. Приложение № 1).

Задание 3

Изучите по таблицам морфологические свойства гемофилов, зарисуйте в дневник и подпишите (см. Приложение № 2).

 

Задание 4

Приготовьте питательные среды, используемые при выделении гемофилов:

Кровяной агар

Способ приготовления: к 100 мл расплавленного и охлажденного до 45°-50⁰С С питательного агара, соблюдая правила асептики, добавте 5% (5 мл крови на 100 мл питательной среды) сердечно - мозгового экстракта или дефибринированной крови человека, разлейте в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в термостате.

Шоколадный агар (с гретой кровью)

Принцип. Прогревание крови способствует освобождению из

эритроцитов факторов роста X (гемин) и V

(никотинамидадениндинуклеотид), необходимых для культивирования

гемофилов.

Способ приготовления: к 100 мл расплавленного и охлажденного до

80°С питательного агара добавте 10 мл дефибринированной

крови человека, тщательно перемешайте, после чего помещайте в

водяную баню и, постоянно встряхивая, держите при температуре 70°С-

80°С до тех пор, пока цвет агара не станет шоколадным (25-30 мин.),

разлейте в стерильные чашки Петри.

Шоколадный бульон

Способ приготовления: к 180 мл питательного бульона добавте 18 мл

крови (9 мл эритоцитной массы и 9 мл сыворотки крупного рогатого скота)

и 9 мл дрожжевого экстракта, разлейте в стерильные пробирки.

Задание 5

Изучите питательные среды, используемые для культивирования гемофилов (демонстрации сред), зарисуйте в дневник, опишите характер роста гемофилов на данных средах (см. Приложение № 3).

 

 

 

1 2 3

Характер роста на средах:

1.

 

2.

 

3.

Задание 6

Проведите 1-й этап бактериологического исследования материала (мокроты) с целью выделения гемофилов.

Задание 7

Изучите методики и проведите постановку тестов идентификации гемофилов.

Биохимическая идентификация микроорганизмов рода Haemophilus

(см. Приложение № 4).

Алгоритм

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Исследование сыворотки больного в реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации позволяет существенно увеличить процент лабораторного подтверждения генерализованных форм менингококковой инфекции. Для получения достоверного результата обязательным условием является исследование сывороток крови больного в динамике, т.е. взятых в разные сроки заболевания (на 1-й и 10 - 12-й дни заболевания). Одной из модификаций микрометода является постановка РНГА в полистироловых пластинах с объемом лунок не менее 300 мл с использованием автоматических дозаторов на 0,5 и 1 мл. Необходимые реагенты: диагностикумы эритроцитарные менингококковые полисахаридные серогрупп А и С; исследуемая сыворотка, разведенная 1:5; забуференный физиологический раствор (ЗФР).

Ход исследования: два ряда полистироловой пластины (для выявления антител к менингококкам серогрупп А и С) заполняют по 1 мл ЗФР, затем проводят двукратное титрование исследуемой сыворотки с разведения 1:5. В каждый ряд добавляют по 0,5 мл соответствующего диагностикума. Пластину встряхивают и помещают в термостат на 2,0 - 2,5 ч при 37 °С, после чего учитывают результаты. Обязательными контролями служит отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума и исследуемой сыворотки. Для этого к 1мл диагностикума добавляют 0, 50 мл ЗФР, а к 1 мл сыворотки -0, 5 мл 1 %-х эритроцитов барана. Учет результатов РНГА проводят по четырехкрестной системе. Четырехкратное и более нарастание титра специфических антител в процессе болезни служит подтверждением диагноза.

Экспресс-метод – иммуноиндикация с помощью реакции иммунофлюоресценции со специфической сывороткой типа b (используют при диагностике менингитов).

 

 

Оценка ___________

Подпись преподавателя ______________

Приложение № 1

КРОВЬ

Показания для проведения микробиологического исследования:

· клиническая картина сепсиса;

· лихорадочные состояния неустановленной этиологии;

· подозрение на инфекционные заболевания.

ЛИКВОР

Показания для проведения микробиологического исследования:

· все случаи предполагаемого менингита;

· осложнения после черепно-мозговых травм, нейрохирургических операций.

Взятие исследуемого материала:

Ликвор получают путем люмбальной пункции, реже при пункции боковых желудочков мозга. Желательно взять материал сразу при поступлении больного в стационар, до начала лечения.

Пункция и взятие материала проводятся с соблюдением всех правил асептики.

Первую порцию ликвора берут в отдельную пробирку для проведения общего клинического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования, собирают в стерильную центрифужную пробирку в количестве 1-2 мл. Ликвор рекомендуется наливать в пробирку шприцем без иглы.

Нельзя касаться руками краев канюли, иглы, пробирки, класть пробку на нестерильные поверхности!

Образец должен быть немедленно доставлен в лабораторию. Если это невозможно, в течение нескольких часов материал сохраняют в термостате при 37^оС или в термосе. Во время транспортировки ликвор необходимо оберегать от охлаждения и перегревания, так как в противном случае некоторые микроорганизмы могут погибнуть. Для транспортировки используют изотермические емкости, грелки с теплой водой и т.д.

 

Приложение № 2

 

 

 

Семейство Pasteurellaceae, род Haemophilus. Некислотоустойчивые факультативно-анаэробные облигатные паразиты, для роста которых необходимы ростовые факторы XY, содержащиеся в эритроцитах. Мелкие неподвижные полиморфные бактерии (кокковидная или палочковидная форма), грамотрицательные. Спор не образуют, отдельные виды формируют капсулу.

 

 

Приложение № 3

 

 

Приложение № 4

Приложение № 5

 

Таблицы: «Интерпретация диаметров зон задержки роста при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диск-диффузии» гемофильной палочки.

 

Примечание: резистентный – устойчивый, умеренно резистентный – промежуточный.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 46