Определение интенсивности микробиологических процессов

Обнаружение в воде или грунтах представителей различных физиологических групп микроорганизмов, осуществляющих трансформацию определенных веществ, еще не является доказательством того, что эти процессы протекают в природных условиях, поскольку на элективных средах микроорганизмы могут развиваться из покоящихся, неактивных форм. Только прямое определение интенсивности процессов в условиях, максимально приближенных к естественным, позволяет подойти к правильной количественной оценке микробиологической деятельности в природных местообитаниях.

В настоящее время существуют различные методы измерения микробиологической активности в морской воде и донных отложениях. В основном они делятся на две большие группы: а) методы, прослеживающие судьбу отдельных субстратов и б) методы оценки изменений в пределах микробного сообщества. В данном разделе рассматриваются методы первой группы.

1. Измерение деструкции органического вещества. Основная роль бактерий в океане состоит в минерализации органического вещества и изучению этой стороны деятельности морских бактерий, или гетеротрофной активности, уделялось наибольшее внимание.

1.1.Кислородный метод. Один из первых, методов оценки деятельности, микроорганизмов в водоеме был предложен Винбергом (1934) для изучения интенсивности фотосинтеза и дыхания водорослей и бактерий. Метод состоит в том, что определяется изменение содержания кислорода в темных и светлых склянках, заполненных исследуемой водой и помещенных в водоем на сутки. Разница между содержанием кислорода в исходной пробе и его содержанием в темной склянку через сутки и соответствует количеству кислорода, пошедшего на окисление органического вещества. Чтобы перейти к количеству органического вещества, полученную величину умножают на коэффициент 0,93, а к количеству углерода - на 0,37 (массовые).

Достоинства этого метода состоят, во-первых, в том, что он не требует применения сложной и дорогостоящей аппаратуры, и, во-вторых,- что очень существенно,- кислород является естественным и универсальным субстратом, потребляющимся при окислении органического вещества.

Метод получил широкое распространение при изучении продукции и деструкции органического вещества в пресноводных водоемах. Однако, низкая чувствительность метода (им улавливаются изменения концентрации не менее 0,01 мг О₂/сутки) позволяет использовать его только в эвтрофных прибрежных водах, лагунах и эстуариях и делает его непригодным для работы в открытом океане, где преобладают олиготрофные условия.

При применении этого метода невозможно разделить количество кислорода, идущего на дыхание бактерий, микрофлагеллят или простейших. Попытки же размерного разделения этих групп приводят к тому, что нарушается сложившееся в естественных условиях равновесие.

1.2. Радиоизотопные методы. Методы обычного химического анализа оказываются недостаточно чувствительными при регистрации изменений концентрации различных соединений, потребляемых или образуемых микроорганизмами в природных условиях. Новые возможности открылись благодаря разработке высокочувствительных радиоизотопных методов.

Использование таких методов в водной микробиологии проводится по общей для различных изотопов схеме. Образец воды или ила инкубируется с меченым радиоактивным соединением (которое вводится непосредственно в образец) в течение непродолжительного времени в условиях, максимально приближенных к естественным. После этого проводится измерение радиоактивности микробной массы или продуктов ее жизнедеятельности, либо той и другой.

Один из таких методов, предложенный Романенко (1965) и примененный им при работе на пресноводных водоемах, позволяет определить интенсивность деструкции органического вещества по гетеротрофной ассимиляции С¹⁴О₂.

В опытах как с чистыми культурами, так и с природной водой было установлено, что между потреблением кислорода и количеством ассимилированной углекислоты имеется постоянное соотношение: на 1 мг использованного на дыхание О₂ ассимилируется 7 мкг С/СО₂. Благодаря этому возможно определять потребление О₂ на дыхание по гетеротрофной ассимиляции С¹⁴О₂. Последнюю определяют, инкубируя пробы воды с меченым С¹⁴ карбонатом в темноте в течение суток.

Следует при этом иметь в виду, что значительные трудности возникают при попытке разделить количество СО₂, ассимилированного хемосинтезирующими и гетеротрофными бактериями. Поэтому к использованию этого метода в тех условиях, где можно ожидать присутствия обеих групп бактерий, следует подходить с большой осторожностью. Для анаэробных условий этот метод непригоден.

Некоторые зарубежные авторы (Banse, Overbeck) считают, что этот метод дает завышенные величины и полученное в условиях пресноводных водоемов соотношение между 0₂ и С, при переходе на тропические морские водоемы нуждается в перепроверке.

За рубежом широкое признание получил метод определения гетеротрофной активности по потреблению низких концентраций органических субстратов (глюкозы, ацетата, гидролизата белка) меченых С^14..

Метод был вначале введен Парсонсом и Стрикландом (.1962) и далее развит Хобби и Райтом (1966), которые показали, что низкомолекулярные органические соединения потребляются фитопланктоном и бактериями по-разному, при низких концентрациях субстрата бактерии получают преимущество благодаря особенностям транспортных систем. Потребление небольших количеств глюкозы и ацетата следует кинетическому уравнению Михаэлиса-Ментена. Максимальная скорость потребления субстрата (V_max) была названа Хобби и Райтом относительным гетеротрофным потенциалом.

Расчет быстроты потребления субстрата этим методом проводится графическим путем. При этом можно измерять природные концентрации субстрата, если они не поддаются измерению химическими методами. Время инкубации с субстратам должно быть кратким.

К числу недостатков этого метода относится прежде всего то, что нет субстратов, которые бы использовались всеми бактериями, и отмечается потеря части С¹⁴ в процессе обработки фильтра.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА 3