Работа 3. Определение активности альдолазы фруктозо-1-монофосфата.

 

Альдолаза фруктозо-1-монофосфата находится лишь в гепатоцитах, и обнаружение активности этого фермента в сыворотке крови является специфическим для поражений паренхимы печени.

Принцип метода

Принцип метода основан на связывании фосфотриоз, образующихся после расщепления ферментов фруктозо-1-фосфата, гидразином, с последующим определением триоз, освобождающихся при щелочном гидролизе продуктов динитрофенилгидразиновой реакции.

Ход работы

В пробирку внести 1 мл сыворотки крови и 0,5 мл субстратного раствора (100 мл бариевой соли фруктозо-1-фосфата растворить в 180 мл дистиллированной воды, прибавить 82 мл гидразин-гидрохлорида и довести рН до 7,4, добавляя 0,75н. NаОН, прилить веронал-мединаловой буфер рН 7,4 до конечного объема 400 мл).

В контрольную пробирку внести 1 мл сыворотки крови. Инкубировать в термостате контрольную и опытную пробу 30 мин при 37°С. После инкубации в контрольную пробирку добавить 0,5 мл субстратного раствора. Остальные реактивы приливать в обе пробирки одновременно. Для дефосфорилирования образовавшейся фосфотриозы прибавить по 1 мл 0,75 н NаОН и оставить при комнатной температуре на 30 мин. Добавить по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина 0,1 % раствора в 2 н НСI (500 мл 2,4-ДНФГ растворяют в 80 мл концентрированной НСI при слабом нагревании и доводят до 500 мл водой) и оставить на 30 мин. Затем добавляют по 3 мл 0,75Н NаОН и через 5 минут опытную пробу колориметрируют на ФЭКе при зеленом светофильтре против контроля.

Количество образовавшихся триоз определяют по стандартной кривой, построенной по диоксиацетону. Активность фермента рассчитывают по формуле А=а/Т, где А – активность фермента (мкмоль) в 1 мл сыворотки за 1 мин; а – количество образовавшихся триоз, рассчитанное по стандартной калибровочной кривой; Т – время инкубации (мин).

Работа 4. Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека.

Принцип метода

В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивность окраски прямопропорциональна концентрации билирубина в растворе.

Разрушение билирубин-альбуминового комплекса (свободный или непрямой билирубин) осуществляется кофеиновым реактивом, который одновременно переводит билирубин в растворимое диссоциированное состояние. Интенсивность образующейся окраски измеряется на ФЭК при зеленом светофильтре (563 нм), а количество билирубина определяется по калибровочному графику.

Ход работы

В 3 пробирки отмерить указанные в таблице реактивы и колориметрировать через 5-10 мин. на ФЭКе в кювете 10 мм против контроля в зеленом светофильтре.

Реактивы	Пробирки
	1-я	2-я	3-я
Сыворотка крови	1 мл	1мл	1мл
Кофеиновый реактив	3,5 мл	3,5 мл	-
Диазореактив	0,5 мл	-	0,5 мл
Физраствор	-	0,5 мл	3,5 мл
Типы билирубина	Общий	Контроль	Прямой (связанный)

 

По калибровочному графику определите содержание общего и связанного билирубина. Вычитая из уровня общего билирубина количество прямого (свободного), рассчитайте содержание нпрямого (свободного) билирубина.

Сопоставьте с нормой у здоровыз людей и сделайте вывод.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

 

1.1. – А

1.2. – В

2.1. – 1-Г, 2-В, 3- Б, 4-А, 5-А

3.1. – все

3.2. – 1,3

4.1. – С(+ - -)

4.2. – А(+ + +)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Симптомы характерны для механической желтухи при закупорке камнем общего желчного протока. В подобных случаях в крови повышается содержание билирубина в значительной степени за счет прямого, т.к. отток желчи нарушен. Кал бесцветен, не содержит стеркобилиногена. Темный цвет мочи обусловлен проникновением в нее прямого билирубина из крови.

Задача 2.

А. Глюконеогенез.

Б. а) – лактат; б) – глицерин; в) – аминокислоты.