Вопрос 10. Культивирование вирусов

Для культивирования вирусов используют:

- культуры клеток,

- куриные эмбрионы

- чувствительных лабораторных животных.

 

1. Культуры клеток = соматические или эмбриональные клетки человека или животных, культивируемые в лабораторных условиях.

Подразделяют:

А) по числу жизнеспособных генераций на первичные, перевиваемые и полуперевиваемые.

Первичные культуры получают из тканей (эмбриональных или нормальных) многоклеточных организмов. Такие клетки не способны к делению – используются однократно.

В основе получения лежит обработка протеолитическими ферментами (трипсином) = первично-трипсинизированные. Н-р, эмбриональная ткань человека, почечная ткань эмбрионов человека и обезьян.

Перевиваемые культуры (стабильные) готовят из опухолевых клеток, способных длительно размножаться in vitro не меняя своих свойств.

Н-р,HeLa – выделены из карциномы шейки матки,

Hep-2 – из карциномы гортани,

Hep-3 – лимфокарцинома,

KB – эпидермоидная карцинома полости рта,

Детройт-6 – костный мозг больного раком легкого.

 

Преимущества перед первичными:

- продолжительность культивирования – десятки лет,

- высокая скорость размножения,

- меньшая трудоемкость,

- сохраняют свои свойства в замороженном состоянии много лет,

- возможность использования международных линий культур.

Но: злокачественный характер и возможность мутаций ограничивает применение для производства вакцин.

 

Полуперевиваемые культуры – диплоидные клетки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они сохраняют свои свойства в течение 20-50 пассажей (пересевов) = до года. При культивировании не претерпевают злокачественного перерождения – преимущество перед перевиваемыми → могут использоваться в производстве вакцин.

 

Б) по технике приготовления – однослойные, суспензионные и органные.

Однослойные – способны прикрепляться и размножаться на поверхности стекла в виде монослоя → наибольшее применение в вирусологии

Суспензионные – размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки → используются при промышленном приготовлении вакцин.

Органные – цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма → применяются ограниченно.

 

Условия культивирования клеток:

1. Питательные среды сложного состава (среда 199, Игла), сод-т источники энергии (глюкозу), минеральные вещества, аминокислоты, витамины, сыворотку крови, факторы роста.

2. Клетки чувствительны к изменениям рН – для контроля рН добавляют индикатор и буферные растворы.

3. Соблюдение правил асептики

4. Использование лабораторной посуды из нейтрального стекла – пробирки, флаконы, матрасы (=флакон 4-х гранной формы)

5. Добавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста бактерий

6. Соблюдение оптимальной температуры культивирования (36-38,5^о).

 

Обнаружение = индикация вирусов в культуре клеток

Индикацию вирусов проводят на основе следующих феноменов:

- цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов или цитопатического эффекта,

- образования внутриклеточных включений,

- образования “бляшек”,

- реакции гемагглютинации, гемадсорбции или “цветной” реакции.

 

А) ЦПД - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов

 

Культура клеток

ЦПД вируса

 

- округление и сморщивание клеток – пикорнавирусы,

- нарастающая деструкция – герпесвирусы,

- пролиферация (образование дырок) – поксвирусы,

-образование гигантских многоядерных клеток = симпласты – парамиксовирусы.

 

Б) Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании.

Н-р, вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения - тельца Гварниери;

- вирус бешенства в цитоплазме образует тельца Бабеша-Негри,

- вирусы герпеса и аденовирусы - внутриядерные включения.

 

В) Бляшки, или “негативные” колонии — ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. “Негативные” колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации.

Г) Реакции:

Г1) Реакция немагглютинации (РГА) основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов.

 

 

Г2) Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты.

 

 

Г3) Цветная” реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.

 

2. Куриные эмбрионы – 8-12-дневные – по сравнению с культурами клеток:

- реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами,

- обладают высокой жизнеспособностью и устойчивостью к неблагоприятным воздействиям,

Важен путь заражения:

При заражении материал вводят:

- в аллантоисную и амниотическую полости = ортомиксовирусы,

- на хорионаллантоисную оболочку = поксвирусы,

- желточный мешок = тогавирусы.

 

Важна температура культивирования:

- для миксовирусов – 33^о

- вируса натуральной оспы – 38,5

- вируса осповакцины - 40

 

Обнаружение вируса:

- на хорион-алантоисных оболочках – беловатые куполообразные бляшки – поксвирусы,

- задержка развития и гибель эмбриона – тогавирусы,

- накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов – ортомиксовирусы.

 

3. Лабораторные животные (взрослые или новорожденные белые мыши, хомяки, кролики, обезьяны) – применяется для выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре клеток или курином эмбрионе,

- заражают: интраназально,

подкожно,

внутримышечно,

внутрибрюшинно,

интрацеребрально,

- обнаруживают вирус по:

- развитию видимых клинических проявлений – параличи – рабдовирусы,

-патоморфологическим изменениям органов и тканей – пикорна-, тога-

- в реакции гемагглютинации с суспензией из органов,

- недостаток:

- высокая вероятность контаминации организма животных посторонними микробами,

- необходимость заражения культуры клеток для выделения чистой культуры вируса.

Вопрос 11. Бактериофаги

Бактериофаги (от бактерия + греч. phagos - пожирающий) - вирусы бактерий, специфически проникающие в бактериальные клетки и поражающие их.

Для обозначения используют:

- название м/о, из которых они выделены: колифаги, стафилофаги,

- буквы латинского алфавита.

Наиболее изучены бактериофаги кишечной группы → Т: Т-четные 2,4,6 и Т-нечетные 1,3,5,7

Строение бактериофагов:

-икосаэдрическая головка,

- хвостовой отросток: внутри – полый цилиндрический стержень, сообщающийся с головкой, а снаружи - чехол отростка, заканчивающийся шестиугольной базальной пластинкой с шипами, от которых отходят фибриллы (нити),

- капсид головки и чехол хвостового отростка бактериофага состоят из полипептидных субъединиц, уложенных по икосаэдрическому (головка) или спиральному (отросток) типу симметрии.

Бактериофаги (фаги) содержат ДНК или РНК: двунитевые-однонитевые, линейные-кольцевые.

Большинство – двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо.

Различают:

- бактериофаги с длинным отростком, имеющие сокращающийся или не сокращающийся чехол,

- бактериофаги с короткими отростками,

-с аналогами отростков,

-без отростков

-и нитевидные.

 

Размер бактериофагов колеблется от 20 до 800 нм (у нитевидных форм).

Бактериофаги, имеющие форму сперматозоида, достигают длины до 200 нм и состоят из хвостового отростка, головки икосаэдрического типа, содержащей нуклеиновую кислоту.

В состав г оловки входит:

- полипептид, состоящий из аспарагиновой, глутаминовой кислот и лизина,

- у некоторых – гистоноподобный белок → суперспирализация ДНК.

В состав сокращающегося чехла у некоторых фагов входит АТФ и ионы кальция.

В состав дистальной части отростка – лизоцим.

Бактериофаги бывают:

- поливалентные – взаимодействуют с родственными видами бактерий

- моновалентные – взаимодействуют с бактериями определенного вида,

- типовые – с отдельными типами бактерий данного вида.

 

 

Тема 4: Экология микроорганизмов

Вопросы для самоподготовки:

1. Микрофлора почвы и методы ее изучения.

2. Микрофлора воды и методы ее изучения.

3. Микрофлора воздуха и методы ее изучения.

4. Естественная микрофлора тела человека, ее значение.

5. Эубиоз и дисбиоз. Лабораторная диагностика, коррекция и профилактика дисбиоза.

6. Эубиотики.

 

Теоретический материал для самоподготовки

Вопрос 1. Микрофлора почвы и методы ее изучения.

В почве – благоприятная среда для существования микроорганизмов: много питательных веществ, влажно, оптимальная температура. Большинство микробов обитают на глубине 10-20 см.

Основные обитатели почвы – сапрофитные микроорганизмы, осуществляющие круговорот веществ.

Патогенные микробы попадают в почву из организма людей и животных, со сточными бытовыми и промышленными водами, с мусором.

Неспорообразующие микробы быстро погибают, но некоторые могут сохраняться долго: например, возбудитель дизентерии от 10 дней до 9 мес,

Возбудитель туберкулеза – от 3 мес. до 7 мес., споры возбудителей столбняка, ботулизма, гангрены – от нескольких лет до нескольких десятков лет, споры возбудителя сибирской язвы – свыше 150 лет.

Оценка санитарного состояния почвы проводится на основании:

- установления общего микробного числа – количество всех микроорганизмов в 1 грамме почвы,

- выявления санитарно-показательных микроорганизмов – бактерий группы кишечной палочки (БГКП).

Различают 3 степени фекального загрязнения почвы:

Свежее – в почве обнаруживаются энтерококки и кишечные палочки,

Несвежее – обнаруживаются цитробактер и энтеробактер,

Давнее –спорообразующая палочка Clostridium perfringens.