Этапы ДНК-диагностики с использованием полимеразной цепной реакции

1. Получение материала для исследования. Длямолекулярно-генетической диагностики используют любые ядросодержащие клетки. Для диагностики наследственного заболевания чаще берут кровь (лейкоциты), реже смывы из полости рта, волосяные фолликулы. Для пренатальной диагностики проводят хориоцентез (получение ворсинчатой оболочки-хориона). плацентоцентез (получение ткани плаценты), амниоцентез (получение амниотической жидкости и выделение из нее клеток), кордоцентез (получение пуповинной крови). Для судебной медицины любые ткани (пятна крови, кожа, сперма и др.), для установления родства с помощью методов геномной дактилоскопии кровь. Для диагностики инфекционных заболеваний –соскобы из влагалища, уретры, бронхолегочные смывы, культуры возбудителей. Для диагностики онкологических заболеваний - красный костный мозг (при лейкозах) и др.

2. Выделение ДНК. Для исследования методом ПЦР пригодны даже небольшие фрагменты слабоочищенной ДНК. Как правило, ДНК из биологического материала при этом выделяют методами лизиса клеток с последующей очисткой от белковых компонентов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет избирательно амплифицировать (многократно редуплицировать) интересующий исследователя участок ДНК в миллионы раз. Принцип ПЦР основан на амплификации ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров (затравок) -прямого и обратного. Праймеры – это фрагменты ДНК, комплементарные противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Таким образом, синтез новой цепи может идти только в одном направлении - начиная с 3'-конца в направлении встречного праймера. Во многом процесс амплификации сходен с редупликацией ДНК в ядре клетки. В реакционной смеси должны присутствовать:

1) матрица - исходная цепь изучаемой ДНК, по образцу которой и происходит синтез новых фрагментов,

2) нуклеотиды - "строительный материал" для наращивания вновь синтезируемых цепей ДНК,

3) фермент ДНК-полимераза, катализирующий процесс синтеза ДНК (в настоящее время используется термостабильная полимераза, выделенная из бактерий горячих источников с оптимумом работы при температуре 72 градуса) и

4) олигонуклеотидные праймеры.

Проведение реакции осуществляется в специальной буферной смеси с определенными концентрациями ионов калия, хлора и точным значением рН.

Смесь ставят в специальный прибор – амплификатор. В нем автоматически происходит смена температур, необходимых для реакции. В результате чего происходит многократная редупликация участка ДНК, который мы хотим выделить. В итоге число копий ДНК увеличивается в миллионы раз.

Полимеразная цепная реакция проходит циклически. Каждый цикл имеет три фазы:

1) Денатурация или плавление – смесь нагревают до 90 –95 градусов. При этом происходит разрыв водородных связей, соединяющих две цепи ДНК.

2) Отжиг – смесь охлаждают, праймеры соединяются с комплементарными участками ДНК.

3) Синтез – смесь вновь нагревают до 72 градусов, начинает работать термостабильная ДНК – полимераза и синтезируется дочерняя цепь ДНК. ДНК-полимераза достраивает нить нуклеотидов комплементарно матричной ДНК. При этом праймер включается в состав вновь синтезируемого участка нуклеиновой кислоты.

 

 

ДНК 1 фаза 2 фаза 3 фаза

 

праймер

 

С помощью ПЦР можно решать следующие задачи:

1) Амплификация желаемого участка ДНК, даже если анализируемый препарат недостаточно очищен или представляет собой сложную смесь молекул. Именно такими препаратами являются образцы крови, мочи, экссудатов, мокроты и других сред организма, а также бактериальные культуры.

Амплификация ДНК, присутствующей в образце в ничтожно малых количествах. По сути, в качестве стартового материала для ПЦР (как видно из схемы на рис.1) достаточно взять не только одну клетку, но и одну молекулу. Это важно при исследовании проб воздуха, воды и т.д. на наличие патогенных возбудителей заболеваний.

К настоящему времени разработано большое количество разновидностей ПЦР, среди которых практическое значение в ДНК –диагностике имеют:

1. Специфическая ПЦР с парой праймеров, применяемая для идентификации возбудителей заболеваний, диагностики наследственных болезней;

2. ПЦР-генотипирование с праймерами, выявляющими генетическую гетерогенность исследуемых организмов, применяемая в судебной медицине, в диагностике наследственных болезней.

Существуют специальные способы проведения ПЦР, позволяющие изучать не только ДНК, но и РНК. Это важно, например, при исследовании РНК-содержащих вирусов (ретровирусы, в том числе ВИЧ, вирус гепатита С, гриппа А и другие), а также при анализе экспрессии различных генов в организме. Подобные методики обычно включают в себя два этапа: обратную транскрипцию и ПЦР на матрице полученной ДНК.

4. Электрофорез фрагментов в ДНК в геле. В гель добавляют бромистый этидий (краска, которая окрашивает ДНК). Фрагменты ДНК перемещаются на определенное расстояние. Участок геля, в котором будут находиться фрагменты ДНК окрасится краской. Одновременно проводят электрофорез контрольных фрагментов.

5. Анализ полученных результатов. Участки геля, в которых находятся фрагменты ДНК, будут давать оранжевое свечение при ультрафиолетовом освещении Совпадение полос контрольного фрагмента и опытного позволят диагностировать наличие искомого гена. Гель можно сфотографировать или его изображение перенести на экран компьютера.