Серологические методы диагностики

ЭПИДЕМИЧЕСКОГО СЫПНОГО ТИФА И

БОЛЕЗНИ БРИЛЛА (БРИЛЛА - ЦИНССЕРА)

 

(Методические указания)

 

1. Введение.

Серологические методы являются обязательным разделом лабораторной диагностики сыпнотифозной инфекции и изучения их эпидемиологии. Серологические реакции выполняются с применением видоспецифических антигенов и вследствие своей высокой специфичности имеют решающее значение для подтверждения риккетсиозной природы заболевания.

Предлагаемые методические рекомендации составлены с целью унификации методик исследований с учетом опыта ряда риккетсиозных лабораторий России и зарубежных стран и в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения.

Методы серологических исследований, приведенные в методических указаниях, обеспечены коммерческими препаратами.

2. Серологические методы диагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилла (Брилла - Цинссера).

2.1. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Позволяет выявить антитела к возбудителю сыпного тифа в ранние, начиная с 5-7-го дня болезни, что придает ей особую ценность. В острый период болезни титры в РНГА колеблются от 1600 до 51200. В основе РНГА лежит специфическая агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных риккетсиозным антигеном.

В основе реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) лежит специфическая агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных риккетсиозным антигеном или иммуноглобулинами, в присутствии соответствующих групповых антител или антигенов.

2.1.1. РНГА с антигенным риккетсиозным эритроцитарным диагностикумом.

РНГА с антигенным риккетсиальным эритроцитарным диагностикумом предназначена для обнаружения и титрования специфических антител риккетсиальной природы в исследуемых сыворотках людей.

Антигенный эритроцитарный диагностикум представляет собой лиофильно высушенную взвесь 3% формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных гидролизованным антигеном (гаптеном) риккетсий.

К антигенному эритроцитарному диагностикуму прилагается лиофильно высушенная 6% взвесь несенсибилизированных (контрольных) формалинизированных эритроцитов барана, предназначенных для контроля исследуемых сывороток и истощения их от неспецифических гемагглютининов, последнее может проводиться и неформалинизированными эритроцитами. Для разведения ингредиентов реакции используют формалинизированный физиологический раствор (ФФР). Последний представляет собой 0,85% раствор хлорида натрия (рН=7.0), к которому добавлен формалин из расчета 0,3 на 100 мл раствора хлорида натрия.

Ингредиенты реакции:

1) Исследуемая сыворотка или исследуемый антиген.

2) Антигенный риккетсиальный или иммуноглобулиновый риккетсиальный эритроцитарный диагностикум или антигены для РНГА.

3) Формалинизированные или негативные эритроциты барана.

4) Физиологический раствор, 1% раствор нормальной кроличьей сыворотки.

5) Формалин.

РНГА можно ставить как макрометодом в стандартных плексигласовых планшетах с лунками, так и микрометодом - в планшетах с лунками типа "U" микротитратора Такачи. При постановке реакции макрометодом эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 1,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 2 мл, а содержимое ампулы с контрольными эритроцитами - в 4 мл ФФР.

При постановке реакции микрометодом антигенный риккетсиальный эритроцитарный диагностикум и контрольные эритроциты используют в виде 0,5% взвесей. Для приготовления таких взвесей содержимое ампулы с эритроцитарным диагностикумом разводят в 6 мл, а с контрольными эритроцитами - в 12 мл ФФР.

Исследуемые сыворотки перед постановкой РНГА инактивируют при +56 град. С в течение 30 минут и истощают эритроцитами барана. С этой целью вскрывают ампулу с контрольными эритроцитами, разводят ее содержимое в 4-12 мл ФФР (в зависимости от постановки макро- и микрометодом), после чего 5 мл полученной 1% взвеси эритроцитов центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. и надосадочную жидкость отсасывают. К осадку добавляют 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, перемешивают, выдерживают 30 минут при +37 град. С и центрифугируют в течение 5 минут при 2500-3000 об/мин. Надосадочную жидкость, представляющую собой истощенную сыворотку, исследуют в РНГА.

Постановка РНГА.

Вначале готовят исходное разведение исследуемой сыворотки (1:25). С этой целью к 1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10, истощенной эритроцитами барана, добавляют 1,5 мл ФФР.

Для приготовления последовательных разведений исследуемой сыворотки в 10 лунок горизонтального ряда планшета наливают по 0,4 (0,05) мл ФФР. В первую лунку добавляют 0,04 (0,05) мл исходного разведения (1:25) исследуемой сыворотки. После тщательного перемешивания переносят 0,4 (0,05) мл содержимого первой лунки во вторую, из второй переносят в третью 0,4 (0,05) мл и т.д. Из первой лунки 0,4 (0,05) мл смеси выливают. Затем в каждую лунку добавляют предварительно хорошо размешанного эритроцитарного диагностикума по 0,1 (0,025) мл, планшет встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Учет результатов реакции - спустя соответственно 4-5 или 2-3 часа. Постановка опыта должна сопровождаться следующими контролями:

1. Контроль исследуемой сыворотки на отсутствие неспецифических гемагглютининов: в лунку планшета наливают 0,2 (0,025) мл исследуемой сыворотки в исходном разведении 1:25, добавляют 0,2 (0,025) мл ФФР и 0,1 (0,025) мл контрольных эритроцитов.

2. Контроль эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной гемагглютинации: в 2 лунки, содержащие по 0,4 (0,05) мл ФФР, добавляют по 0,1 (0,025) мл эритроцитарного диагностикума.

3. Заведомо положительный контроль: постановка РНГА с тест - сывороткой к риккетсиям Провачека, прилагаемой к данной серии эритроцитарного диагностикума.

Учет результатов РНГА.

Учет результатов реакции проводят по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. Реакцию считают положительной (оценивают на "+"), если агглютинировавшие эритроциты выстилают дно лунки, образуя по форме перевернутый купол с ровным или фасеточным краем. Титром исследуемой сыворотки считают максимальное ее разведение, которое вызывает четкую агглютинацию эритроцитарного диагностикума.

Реакцию считают отрицательной (оценивают на "-") при оседании эритроцитов на дно лунки в виде диска или компактного кольца с четким ровным краем. В сомнительных случаях реакцию оценивают на "+/-".

2.1.2. РНГА с препаратом на основе нативных эритроцитов.

При отсутствии коммерческого антигенного риккетсиального эритроцитарного диагностикума РНГА можно ставить с нативными эритроцитами барана, предварительно сенсибилизированными коммерческим антигеном (гаптеном) риккетсий для реакции гемагглютинации. Антиген растворяют в физиологическом растворе (рН=7,0) в соответствии с указаниями на этикетке ампулы. 4 мл растворенного антигена смешивают с 0,1 мл осадка отмытых эритроцитов барана, выдерживают смесь в течение 1 часа при +37 град. С, встряхивая каждые 15 минут, затем центрифугируют 10 минут при 2500-3000 об/мин., надосадочную жидкость отсасывают, а осадок суспендируют в 10 мл физиологического раствора (рН=7,0), получая 10 мл 1% взвеси сенсибилизированных эритроцитов. Такой препарат может сохраняться в течение нескольких дней при +4 град. С без снижения активности. РНГА в этом случае ставят на обычном физиологическом растворе (рН=7,0), в остальном подготовка ингредиентов, постановка реакции и учет результатов проводятся точно также, как при использовании сухого антигенного риккетсиального эритроцитарного диагностикума, за исключением первого разведения исследуемой сыворотки, которое берется не 1:25, а 1:250.

2.2. Метод флуоресцирующих антител.

Метод флуоресцирующих антител (МФА) - экспресс - метод - сочетает высокую чувствительность люминесцентного анализа с высокой специфичностью иммунологического метода. МФА применяется в лабораторной диагностике с целью выявления риккетсиальных антигенов и антител. Этот метод используют в прямой и непрямой модификации с применением флуоресцирующих конъюгатов, полученных на основе иммуноглобулинов специфических сывороток.

Ингредиенты и оборудование.

1. Риккетсиальные корпускулярные антигены (для МФА).

2. Специфические антириккетсиальные сыворотки.

3. Люминесцирующие специфические риккетсиальные сыворотки.

4. Люминесцирующие антивидовые сыворотки к иммуноглобулинам человека и различного вида животных.

5. Люминесцирующие Fab-фрагменты риккетсиальных антител.

6. Забуференный физиологический раствор рН = 7,2.

7. Спирт 96 град.

8. Ацетон.

9. Дистиллированная вода.

10. Бычий альбумин, меченый родамином или Эванс.

11. Люминесцентный микроскоп (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Л, ЛЮМАМ).

12. Предметные стекла.

13. Чашки Петри.

14. Емкости для промывания стекол.

15. Фильтровальная бумага.

2.2.1. Прямой метод флуоресцирующих антител.

Прямой метод флуоресцирующих антител (пМФА) используется с целью выявления риккетсиальных антигенов в биологических пробах и объектах внешней среды.

Метод осуществляют следующим образом. На тщательно вымытые и обезжиренные предметные стекла делают тонкие мазки или отпечатки исследуемого материала. После высыхания мазки фиксируют этиловым спиртом или ацетоном в течение 30 минут. По мазку восковым карандашом делают ряд окружностей диаметром 0,5 см, в зависимости от количества искомых антигенов, чтобы создать барьер, препятствующий растеканию люминесцирующей сыворотки.

На эти поля фиксированных и высушенных мазков наносят по капле разведенных флуоресцирующих сывороток против искомых антигенов (рабочее разведение указано на ампуле) в смеси с равным объемом Эванса 0,1% или бычьего альбумина, меченого родамином (в смеси оба раствора должны быть в рабочем разведении). В контрольное поле наносят гетерологичную флуоресцирующую сыворотку так же в смеси с бычьим альбумином. Обработку мазков проводят 30 минут при температуре +37 град. С во влажной камере (чашка Петри с увлажненным дном), что предупреждает высыхание конъюгата. Отмывание мазков от избытка флуоресцирующей сыворотки производят в фосфатном буферном растворе (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут. После ополаскивания дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют в люминесцентном микроскопе.

Учет результатов реакции.

Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе, объектив 90х, окуляр 10х или 7х. Первичные светофильтры для МЛ 2-ФС-1-4; СЗС 7-2; БС-8-2, окулярный или запирающий - 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС 21-2, ФС 1-6; окуляр зеленый (т.е. фильтры, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатом и изотиоцианата флуоресцеина).

Просматривают не менее 10-20 полей зрения. Оценку результатов пМФА проводят на основании количества, яркости флуоресцеина и морфологических особенностей риккетсий. Для этого используют условную систему обозначения при помощи крестов:

"+++++" - яркая, сверкающая флуоресценция;

"+++" - отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция с характерным для данного флуорохрома цветов (в данном случае зеленый).

Морфология риккетсий выявляется хорошо, у отдельно лежащих корпускул видны четкие колечки (ободки) за счет более яркого свечения комплекса антител с поверхностным антигеном;

"++" - флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко;

"+" - флуоресценция очень слабая, морфология риккетсий различима плохо, цвет неопределенный;

"-" - флуоресценция отсутствует.

Результат считается положительным при обнаружении в некоторых полях зрения не менее 5 риккетсий с интенсивностью свечения возбудителя не менее, чем на "+++" при четко отрицательном контроле.

2.2.2. Непрямой метод флуоресцирующих антител.

Непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА) или реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) используют с целью выявления специфических антител у больных и переболевших риккетсиозами людей и животных.

Метод используют следующим образом. В ампулу с сухим риккетсиальным корпускулярным антигеном за 2 часа до приготовления препарата добавляют 1 мл дистиллированной воды с целью насыщения корпускул риккетсий влагой. Из этого основного разведения готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обечпечивающей в каждом поле зрения примерно до 100 риккетсиальных клеток. На предметном стекле, хорошо вымытом и обезжиренном, наносят капли антигена в соответствующем рабочем разведении. На каждое стекло наносят 8 капель. Этого количества достаточно для испытания одной сыворотки. Если в вашем распоряжении имеется взвесь антигена, то с ней поступают следующим образом: из основного раствора готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающем в каждом поле зрения около 100 риккетсиальных клеток. На предметное стекло, хорошо вымытое и обезжиренное наносят, по 8 капель антигена, тщательно перемешанного пипетированием в соответствующем рабочем разведении кончиком канцелярского пера или туберкулиновым шприцом со срезанным концом.

Мазки хорошо высушивают на воздухе, фиксируют спиртом или ацетоном (приобретенные антигенные пятна уже зафиксированы) в течение 20 минут и сохраняют до использования при температуре от 0 до +4 град. С, в пределах месяца. Препараты необходимо оберегать от увлажнения.

Из испытуемых сывороток, предварительно прогретых в течение 30 минут при +56 град. С, готовят двукратные разведения в физиологическом растворе (от 1:20 до 1:2560, а при необходимости и выше).

Капли из соответствующих разведений сыворотки наносят на мазки антигена и выдерживают 45 минут во влажной камере при +37 град. С. Затем препарат промывают фосфатным буфером (рН=7,2-7,4) в течение 10 минут и высушивают на воздухе.

После высушивания на мазки наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма - глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере 30 минут при +37 град. С. В качестве антивидовых препаратов применяют люминесцирующие сыворотки против гамма - глобулина человека и животных в зависимости от видовой принадлежности испытуемых сывороток. На этом этапе выполнения реакции также рекомендуется использование бычьего альбумина, меченого родамином, или 0,1% раствора Эванса для гашения неспецифического свечения, которые смешиваются с антивидовой люминесцирующей сывороткой в равном объеме, с тем, чтобы иметь рабочие дозы указанных ингредиентов. Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 минут и высушивают на воздухе.

В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную сыворотки и контроль люминесцирующей антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно антивидовой люминесцирующей сывороткой.

Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливает свечение риккетсий на "++", при наличии свечения на "+++" или "++++" в предыдущем разведении.

Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки - свечение риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей антивидовой сывороткой в рабочем разведении.

2.3. Реакция связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК) является универсальной, так как дает возможность получения объективных результатов при проведении текущей и ретроспективной диагностики. Комплемент связывающие антитела сохраняются в сыворотке переболевших людей десятки лет. В этой связи РСК незаменима для ретроспективной диагностики.

РСК имеет целью определение в исследуемых сыворотках специфических антител.

Сущность реакции заключается в связывании комплемента комплексом антиген - антитело, что обнаруживается в присутствии индикатора: бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой. При образовании специфического комплекса антиген - антитело последний связывает комплемент, вследствие чего после добавки гемолитической системы не возникает гемолиза бараньих эритроцитов. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов.

Таким образом, положительный результат РСК характеризуется оседанием эритроцитов (задержкой гемолиза), а отрицательный - феноменом гемолиза эритроцитов.

Ниже приведены две схемы постановки РСК, отличающиеся рядом преимуществ в сравнении с ранее применявшимися в нашей стране (Голиневич, 1962):

1) уменьшением объема использованных ингредиентов;

2) упрощением схемы титрования комплемента;

3) получением более достоверных результатов реакции за счет титрования комплемента в присутствии антигенов (риккетсиальные антигены могут поглощать некоторое количество комплемента, что следует принимать во внимание и учитывать при постановке реакции).

Ингредиенты реакции: 1) испытуемая сыворотка, 2) антиген; 3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.

Обязательным условием постановки РСК является использование точно оттитрованных компонентов. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл (1-я схема) или 0,6 мл (2-я схема).

Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо вымытой и высушенной в суховоздушном шкафу.

Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку. Все разведения делают в свежеприготовленном стерильном физиологическом растворе (0,85% раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде).

Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30 минут при 56-58 град. С (для разрушения содержащимися в ней комплемента и ингибиторов).

Риккетсиальные антигены растворяют в указанном на этикетке ампулы количестве физиологического раствора, которое соответствует рабочему разведению, определенному предприятием - изготовителем.

Сухой комплемент разводят согласно прилагаемой к этому препарату инструкции. Гемолитическая сыворотка выпускается в ампулах: это - сыворотка кролика, иммунизированного по определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. На этикетке ампулы гемолитической сыворотки указан ее титр. В реакции используют разведение гемолитической сыворотки в три раза меньше титра, указанного на этикетке: например, титр, указанный на этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку, разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку ее титра производят следующим образом. Готовят основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл гемолитической сыворотки +9,9 мл физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно разливают по 0,1 мл разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1:1000 до 1:3600, в каждую пробирку добавляют комплемент в разведении 1:10 в объеме 0,1 мл и по 0,1 мл 3% взвеси бараньих эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,2 мл физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в термостате при +30 град. С в течение 1 часа. По наличию полного гемолиза эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.

 

Таблица 1

 

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

 

-------------------T---------------------------------------------------------------------

¦ Ингредиенты ¦ Разведение гемолитической сыворотки ¦

¦ опыта +------T------T------T------T------T------T------T------T------T------+

¦ ¦1:1000¦1:1200¦1:1600¦1:1800¦1:2000¦1:2400¦1:2800¦1:3000¦1:3200¦1:3600¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦Гемолитическая сы-¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦

¦воротка (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦3% взвесь бараньих¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦

¦эритроцитов (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦Комплемент в раз-¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦

¦ведении (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦Физ. раствор (мл) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

+------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+

¦Оценка результатов¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦опыта ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

L------------------+------+------+------+------+------+------+------+------+------+-------

Титр гемолитической сыворотки 1:1800.

 

Для получения эритроцитов барана кровь, взятую из яремной вены животного, дефибринируют во флаконе со стеклянными круглыми бусами путем встряхивания в течение 10-15 минут, процеживают через стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до +4 град. С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов. Эритроциты хранят обычно в течение 1 месяца в консерванте "Консервант крови N 7Б", выпускаемом Пензенским заводом медицинских препаратов, или каком - либо другом консерванте.

1-я схема постановки РСК.

Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы. Титрование комплемента ведут в присутствии антигена. Из основного разведения комплемента 1:10 готовят различные дозы в 1 мл (таблица 2).

 

Таблица 2

 

-----------------------------T-----------------------------------

¦ Ингредиенты ¦ Дозы комплемента ¦

¦ реакции +---T---T---T---T---T---T---T---T---+

¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Комплемент в разведении 1:10¦0,1¦0,2¦0,3¦0,4¦0,5¦0,6¦0,7¦0,8¦0,9¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Физиологический раствор (мл)¦0,9¦0,8¦0,7¦0,6¦0,5¦0,4¦0,3¦0,2¦0,1¦

L----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+----

Затем ставят опыт титрования комплемента.

 

Таблица 3

 

-----------------------------T-----------------------------------

¦ Ингредиенты ¦ Дозы комплемента ¦

¦ реакции +---T---T---T---T---T---T---T---T---+

¦ ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Комплемент в различных дозах¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Антиген (мл) ¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Физиологический раствор (мл)¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦0,1¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Гемолитическая система (мл) ¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦0,2¦

+----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+

¦Оценка результатов ¦4+ ¦3+ ¦2+ ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦

L----------------------------+---+---+---+---+---+---+---+---+----

Оттитрованный комплемент ставят в термостат при +37 град. С на 1 час. Через час добавляют гемолитическую систему, состоящую из равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и гемолитической сыворотки в тройном титре (выдержанную предварительно в термостате в течение 30 минут) и через 30 минут производят учет результатов.

Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++); частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом (+).

Единицей комплемента считают то наименьшее ее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я доза. Рабочая доза комплемента равна одной полной единице комплемента при проведении связывания в термостате при +37 град. С в течение 1 часа.

Постановка основного опыта.

1 этап. Инактивированные испытуемые сыворотки разводят обычно двукратно в пределах 1:10 - 1:640 и выше в зависимости от срока болезни физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл. К различным разведениям их добавляют по 0,1 м: антигена и комплемента в рабочих дозах.

К каждому опыту ставят следующие контроли:

1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в исходном разведении + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора, 0,1 мл комплемента в рабочей дозе);

3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора);

4) контроль гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора);

5) контроль заведомо положительной сыворотки, которую титруют до ее титра;

6) контроль заведомо отрицательной сыворотки, которую титруют в 2-х-3-х разведениях (1:10 - 1:40), включая так, же как и для п. 5 контроль сывороток в исходных разведениях.

После добавления всех указанных ингредиентов и тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат при +37 град. С на 1 час.

2 этап. Вынимают пробирки из термостата и добавляют в каждую по 0,2 мл гемолитической системы (предварительно выдержанной в термостате 30 минут). Опять тщательно встряхивают и ставят пробирки в термостат на 20-30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях.

2-я схема постановки РСК (по Fiset).

Указанная схема отличается от первой общим объемом реакции - 0,6 мл, упрощенным титрованием комплемента, которое проводится при температуре +4 град. С 16-18 часов не в день постановки реакции, 1-2 раза на протяжении месяца при условии работы с одной серией эритроцитов и комплемента: сухого или нативного, взятого у морских свинок и хранящегося при температуре не выше +/-20 град. С (однако размороженный комплемент повторному замораживанию не подлежит).

Титрование комплемента.

Готовят основное разведение комплемента 1:10 (в случае наличия сухого комплемента содержимое ампулы растворяют в 10 мл физиологического раствора), из которого по схеме получают последующие его разведения (обычно до 1:30 - 1:40) (таблица 4).

 

Таблица 4

 

-----------------------------T-----------------------------------

¦ Ингредиенты ¦ Разведения комплемента ¦

¦ +-----T-----T-----T-----T----T------+

¦ ¦1:15 ¦1:18 ¦1:20 ¦1:25 ¦1:30¦и т.д.¦

+----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+------+

¦Комплемент 1:10 (мл) ¦ 1 ¦ 1 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦0,5 ¦ ¦

+----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+------+

¦Физиологический раствор (мл)¦ 0,5 ¦ 0,8 ¦ 0,5 ¦ 0,75¦1,0 ¦ ¦

L----------------------------+-----+-----+-----+-----+----+-------

Из приготовленных разведений комплемента переносят по 0,1 мл его в контрольный ряд (без антигена) и опытные ряды (по числу использованных в РСК антигенов) (таблица 5).

 

Таблица 5

 

----------------------------T------------------------------------

¦ Ингредиенты реакции ¦ Разведение комплемента ¦

+---------------------------+------------------------------------+

¦ Контрольный ряд (оценка качества комплемента) ¦

+---------------------------T----T----T----T----T----T----T------+

¦ ¦1:10¦1:15¦1:18¦1:20¦1:25¦1:30¦и т.д.¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Комплемент в различных¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦

¦разведениях (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Физиологический раствор¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Гемолитическая система (мл)¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Оценка результата ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦ Опытный ряд (оценка антикомплементарных свойств антигена) ¦

+---------------------------T----T----T----T----T----T----T------+

¦Комплемент в различных¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦

¦разведениях (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Антиген в рабочей дозе (мл)¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Физиологический раствор¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Гемолитическая система <*> ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+---------------------------+----+----+----+----+----+----+------+

¦Оценка результата ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦+++ ¦ ¦

L---------------------------+----+----+----+----+----+----+-------

--------------------------------

<*> - Добавляют на второй день титрования комплемента (после 16-18 часов экспозиции при температуре + 4 град. С).

 

Дозу комплемента с антигеном, дающую полный гемолиз, считают за титр комплемента или "полную единицу", в данном примере она соответствует разведению комплемента 1:20. Раз оттитрованной рабочей дозой комплемента можно пользоваться в течение месяца при работе с этой серией комплемента и эритроцитов.

После 30-минутной экспозиции при температуре +37 град. С учитывают результаты.

При постановке реакции "холодным методом" (0 град. С) рабочая доза комплемента соответствует двум полным единицам в виде удвоенного объема комплемента - 0,2 мл. Например, полный гемолиз в опытном ряду, т.е. в присутствии антигена, отмечен в пробирке при разведении комплемента 1:20, а в контрольном ряду - 1:25. В итоге рабочая доза комплемента при использовании в реакции данного антигена соответствует разведению 1:20 в объеме 0,2 мл, поскольку в этих условиях не выявляются антикомплементарные свойства антигена. Например, на 100 пробирок необходимо приготовить 20 мл разведенного 1:20 комплемента (из расчета 0,2 мл на пробирку), следовательно, нужно взять 1,0 мл цельного комплемента и 19,0 мл физиологического раствора.

В случае, если в реакции используют не 1, а 2 или 3 разного вида антигенов, то и титрование комплемента проводят в присутствии всех видов антигенов, после чего выбирают соответствующие дозы комплемента.

При постановке реакции при +37 град. С рабочая доза комплемента составит 1 полную единицу, т.е. объем его не 0,2, а 0,1 мл и общий объем РСК в этом случае будет 0,5 мл.

В основном опыте контролируют рабочую дозу комплемента, полную единицу комплемента и ее половину ("холодное" связывание) или полную единицу комплемента и ее половину (связывание при +37 град. С). Иными словами, в первом случае: 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора; 0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,3 мл физиологического раствора, и 0,05 мл комплемента в рабочей дозе + 0,35 мл физиологического раствора. В 1 и 2-ом контролях должен наблюдаться полный гемолиз, в 3-ем - задержка его на три - два креста. Во 2-м случае (т.е. связывание при +37 град. С) для контроля используют 2 последние дозы.

Постановка основного опыта.

Инактивированные испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки (или лунки полистероловых панелей) по 0,1 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют по 0,1 мл антигена и 0,2 мл комплемента в его рабочей дозе.

Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:

1} контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сывороток, в исходном разведении + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

2} контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,2 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

3} контроль комплемента (как указано выше);

4} контроль гемолитической системы (0,4 мл физиологического раствора).

Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями. Положительную сыворотку разводят до ее титра. После тщательного встряхивания пробирки ставят в холодильник при 0 град. С на 16-20 часов (1-й этап реакции, таблица 6).

 

Таблица 6

 

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ОПЫТА РСК

 

------------T-------------------------------------T-----T-----T-----T-----

¦ ¦ Разведение сывороток ¦Конт-¦Конт-¦Конт-¦Конт-¦

¦Ингредиенты¦ ¦роль ¦роль ¦роль ¦роль ¦

¦ реакции +----T----T----T----T-----T-----T-----+сыв. ¦анти-¦ком- ¦гем. ¦

¦ ¦1:10¦1:20¦1:40¦1:80¦1:160¦1:320¦1:640¦ ¦гена ¦плем.¦сист.¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦ 1-й этап ¦

+-----------T----T----T----T----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----+

¦Сыворотка ¦ ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦ - ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Антиген ¦ ¦0,1 ¦0,1 ¦0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ - ¦ 0,1 ¦ - ¦ - ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Комплемент ¦ ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Физиологи- ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,1 ¦ 0,1 ¦ 0,2 ¦ - ¦

¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦ Экспозиция 16-20 часов при + 4 град. С ¦

+-------------------------------------------------------------------------+

¦ 2-й этап ¦

+-----------T----T----T----T----T-----T-----T-----T-----T-----T-----T-----+

¦Гемолитиче-¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦

¦ская систе-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ма (мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦Физиологи- ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦

¦ческий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦раствор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦(мл) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+-----------+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+

¦ Экспозиция 20-30 минут при + 37 град. С ¦

L--------------------------------------------------------------------------

 

На втором этапе в каждую пробирку или лунку панелей добавляют по 0,2 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в термостате при + 37 град. С 30 минут. Пробирки или панели тщательно встряхивают и ставят в термостат на 20-30 минут в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях. В пробирки с заведомо положительной сывороткой и в контроле гемолитической системы должна наблюдаться задержка гемолиза.

Оценка главного опыта заключается в степени задержки гемолиза в пробирках с испытуемыми сыворотками по сравнению с соответствующими контролями, в которых возник полный гемолиз. Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, характеризующееся задержкой гемолиза не менее чем на три креста.

Результаты реакции считают достоверными, если в контролях испытуемых сывороток, в контроле антигена и рабочей дозе комплемента имеется полный гемолиз, а в контроле гемолитической системы гемолиз отсутствует. Диагностический титр может считаться 1:10 при условии нарастания титра в 4 раза (и более) с интервалом в 7 дней.

В РСК оба ингредиента используются в дозе, равной 1 ЕД. Дозы определяют путем перекрестного ("шахматного") титрования.

2.4. Реакция агглютинации с риккетсиями Провачека (РА).

Реакция агглютинации (РА) является наиболее простым тестом и может быть применена для лабораторной диагностики не только сыпного тифа, но и большинства риккетсиозов. Вместе с тем для ее постановки необходимы дорогостоящие тщательно очищенные корпускулярные риккетсиальные антигены.

Ее преимуществом является минимальное число компонентов реакции (исследуемая сыворотка и антигенный диагностикум) и более раннее выявление агглютининов.

Метод обладает, вместе с тем, существенными недостатками:

1) для исследований пригодны только свежие негемолизированные сыворотки, хранящиеся не более 14 дней;

2) затруднена ретроспективная диагностика, поскольку агглютинины выявляются менее продолжительное время после болезни;

3) в случае использования бесцветного антигена - субъективизм при оценке результатов.

Ингредиенты реакции: 1) исследуемая инактивированная при +56 град. С в течение 30 минут прозрачная, свежая сыворотка, 2) корпускулярный антиген, 3) физиологический раствор.

РАР выполняется в макро- (0,4 мл; 6 капель - по Мосингу) и микровариантах (0,05 мл) всегда объемным способом, что ведет к разбавлению вдвое начального разведения сыворотки (например, сыворотка, разведенная 1:10 в объеме 3 капель, при добавлении антигена в объеме 3-х капель будет иметь разведение 1:20).

Для микроварианта РА используют бесцветные корпускулярные антигены, которые разводят согласно этикетке на ампуле, и жидкий антиген коричневого цвета, приготовленный из риккетсий Провачека, культивируемых в кишечнике вшей (для РАР может быть использован также сухой люминесцирующий диагностикум из риккетсий для ИФРМА).

Постановка РА. Макровариант.

Готовят в агглютинационных пробирках или пластинах последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки с 1:5 в объеме 0,2 мл или 3-х капель. С этой целью вносят во все пробирки, кроме первой, по 0,2 мл физиологического раствора (или по 3 капли). В