Работа 1. Влияние фитогормонов на рост семядолей

Цель: определить влияние фитогормонов на рост семядолей отдельных видов растений.

Объекты, реактивы, оборудование: раствор АБК в концентрации 1 мг/л; 6-БАП — 10 мг/л; 6-БАП — 100 мг/л, технические и торсионные весы, чашки Петри, фильтровальная бумага.

Краткие сведения

Прорастание семян сопровождается активизацией в них метаболизма. В семядолях при прорастании происходит активация и новообразование ферментных систем, необходимых как для обеспечения использования запасных веществ, так и для превращения семядолей из запасающего органа в зеленый лист. Эти процессы протекают под контролем осевых частей зародыша. Большая роль в этом контроле принадлежит фитогормонам (интегративная функция). При прорастании семян фитогормоны поступают в семядоли из осевых частей зародыша и влияют на развитие активности ферментов, участвующих в распаде запасных веществ. Образующиеся при этом продукты распада поступают в осевые части зародыша и обеспечивают их рост.

Высокой чувствительностью к экзогенным фитогормонам обладают изолированные семядоли тыквы, так как после изоляции в них происходит быстрое, истощение запаса эндогенных гормонов.

В работах О. Н. Кулаевой было показано, что экзогенный цитокинин значительно активизирует рост семядолей. При этом влияние цитокинина распространяется на все стороны формирования внутриклеточных структур и обмен веществ семядолей. Цитокинин резко ускоряет использование в клетках семядолей запасных веществ, ускоряет и усиливает формирование мембранного аппарата хлоропластов — гран и ламелл стромы, рост хлоропластов и их деление. Цитокинин стимулирует формирование митохондриального аппарата клеток семядолей, развитие эндоплазматического ретикулума (в основном шероховатого).

В соответствии с активизацией роста семядолей и процессов внутриклеточной дифференциации, связанной с их превращением в зеленый лист, цитокинины запускают в семядолях синтез самых разных ферментов, необходимых для развертывания указанных физиологических программ. Цитокинин увеличивает в семядолях активность эндопептидазы, участвующей в гидролизе белков, щелочной и кислой пирофосфатаз, которые разрушают пирофосфат, образующийся при синтезе различных биополиме­ров, и тем самым способствуют протеканию этих синтезов. Цитокинин активирует малик-энзим, участвующий в обмене органических кислот, и рибулезобисфосфаткарбоксилазу — ключевой фермент фотосинтеза. Ферменты по степени их активации цитокинином можно разделить на две группы: одна по своему ответу на фитогормон коррелирует с ростом семядо-лей, другая — с накоплением в них хлорофилла. Ферменты первой группы более тесно связаны с программой роста, второй — с биохимической дифференциацией хлоропластов.

Цитокинин стимулирует синтез белка в клетках, действуя на разных уровнях этого процесса. Гормон активирует синтез РНК, увеличивает число рибосом в клетке, повышает их активность в синтезе белка.

Антагонистом цитокинина во всех описанных выше процессах является АБК. Она прекращает рост изолированных семядолей тыквы, ингибируя как рост клеток, так и их деление, подавляет процессы внутриклеточной дифференциации, формирование мембранного аппарата хлоропластов, угнетает синтез ферментов, связанных как с ростом семядолей, так и с дифференциацией в них хлоропластов. Между АБК и цитокинином проявляется четкий антагонизм: цитокинин снижает ингибирующее действие АБК, АБК подавляет вызванную цитокинином стимуляцию перечисленных процессов.

Угнетение синтеза белка в изолированных семядолях тыквы под действием АБК происходит как за счет подавления синтеза-РНК, так и путем торможения формирования полисом. АБК тормозит синтез хлорофилла, действуя на образование и транспорт δ-аминолевулиновой кислоты и на ферменты, участвующие в ее синтезе. Действие и цитокинина, и АБК, как любого фитогормона зависит от их концентрации.

 

Ход работы

 

Семена тыквы, фасоли, гороха, рапса проращивают в течение 96 ч на влажной фильтровальной бумаге в темноте при температуре +25° С, затем отделяют семядоли от растения и помещают в чашку Петри на воду, ставят чашку в термостат при температуре +25° С. В изолированных семядолях в темноте происходит быстрое истощение эндогенных гормонов. Через 24 ч семядоли переносят на исследуемые растворы и помещают в фототермокамеру при температуре +28° С и круглосуточном освещении на 48 ч. Исследуемые растворы: контроль — дистиллированная вода; АБК —
1 мг/л; 6-БАП — 10 мг/л; 6-БАП — 100 мг/л.

Развитие семядолей представляет собой процесс, в течение которого одновременно идет новообразование структурных элементов клетки и расходование ее запасных веществ. Сухая масса при этом практически не меняется. В связи с этим рост изолированных семядолей тыквы удобно определять по изменению их сырой массы.

В связи с этим, взвешивают на технических весах все семядоли каждого варианта, подсчитывают их количество и определяют среднюю массу каждой семядоли. Результаты взвешиваний заносят в таблицу.

 

Таблица 1

Вариант	Масса семядолей, мг
			среднее
контроль
АБК, 1 мг/л
6-БАП, 10 мг/л
6-БАП, 100 мг/л

 

 

Задача. Определить изменение сырой массы семядолей в зависимости от:

1) вида растения;

2) от химической природы регуляторов роста;

3) от концентрации биологически активного вещества.

Средние показатели записать по образцу таблицы 2.

 

 

Таблица 2

Вариант	Масса семядолей, мг
Тыква	Фасоль	Горох	рапс
контроль
АБК, 1 мг/л
6-БАП, 10 мг/л
6-БАП, 100 мг/л

Сделать вывод об особенностях роста семядолей в зависимости от вида растения, от концентрации и химической структуры регулятора роста.

 

 

Работа 2. Определение содержание хлорофилла в семядолях

Цель: определить влияние различных концентраций фитогормонов на содержаниехлорофилла в изолированных семядолях отдельных видов растений.

 

Объекты, реактивы, оборудование: раствор АБК в концентрации 1 мг/л; 6-БАП — 10 мг/л; 6-БАП — 100 мг/л, СаСО₃, 80%-й раствор этанола; ступки с пестиками; стеклянный фильтр №3, мерные колбы объемом 25 мл, цилиндры объемом 25 мл, колба Бунзена, пробирки, пипетки, сверло (пробковое) диаметром 0,5 см, фототермокамера с температурой 28⁰С, термостат, технические и торсионные весы, спектрофотометр.

 

Ход работы

Навеску семядолей (200 мг) растирают в ступке с небольшим количеством песка и СаСО₃ (на кончике скальпеля), экстрагируют пигменты раствором этанола, фильтруют экстракт через стеклянный фильтр и доводят объем в мерной колбе до 25 мл. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре λ = 665 и 649 нм. Количество хлорофилла (а+b) определяют по формуле:

С _а+b = 6,45•Е₆₆₅+ 17,72 •Е₆₄₉, мг/л

Пересчитывают количество хлорофилла на 1 г сырой массы.

Результаты измерений заносят в таблицу.

 

Таблица 1

Вариант	Оптическая плотность, ед	Количество хлорофилла, мг/л
649, нм	665, нм
контроль
АБК, 1 мг/л
6-БАП, 10 мг/л
6-БАП, 100 мг/л

 

Задача. Определить изменение содержания хлорофилла в семядолях в зависимости от:

4) вида растения;

5) от особенностей регулятора роста;

6) от концентрации биологически активного вещества.

Содержание хлорофилла в семядолях записать по образцу таблицы 2.

 

Таблица 2

Вариант	Количество хлорофилла, мг/л
Тыква	Фасоль	Горох	рапс
контроль
АБК, 1 мг/л
6-БАП, 10 мг/л
6-БАП, 100 мг/л

 

Сделать вывод об особенностях ростовых процессах в семядолях в зависимости от накопления в них фотосинтетических пигментов у различных растений, при воздействии на них регуляторами роста.