Определение концентрации альбумина в сыворотке крови по реакции с бромкрезоловым зеленым

 

 

Принцип метода: Метод основан на образовании окрашенных комплексных соединений при взаимодействии альбумина с бромкрезоловым знленым в слабокислой среде в присутствии детергента.

Интенсивность окраски пробы при длине волны 630 нм прямо пропорциональна концентрации альбумина в ней.

 

Линейность метода: 20-60 г/л.

Норма: 35-50 г/л. (18-25°С);

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 630 (590-640) нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 18-25°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 5мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови/ плазма негемолизированные;

5) Рабочий реагент (бромкрезоловый зеленый 74 мг, детергент Тритон Х-100 в ацетатном буфере);

6) Стандарт (раствор альбумина 40 г/л);

7) Дистиллированная вода.

 

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	5 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	5 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	5 мкл	--
4. Рабочий реагент	1 мл	1 мл	1 мл

 

Перемешать тщательно в течение 15 секунд содержимое пробирок, избегая образования пены. Инкубировать при комнатной температуре 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 630 (590-640) нм. Окраска стабильна в течение 8 часов.

 

Расчет

 

Расчет по стандарту концентрации альбумина в сыворотке (плазме) проводят по формуле:

 

Аоп С (г/л) = ----------- ´ Сст, Аст

 

где А_оп и А_ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта.

Если концентрация альбумина превышает 60 г/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или плазма) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: Гиперальбуминемия наблюдается при тех же состояниях, что и гиперпротеинемия.

Гипоальбуминемия наступает при больших потерях белка, связанных с кровотечением, нарушением синтеза белка в печени и усилением процессов его распада.

 

Лабораторная работа № 18.

Определение концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови иммунотурбидиметрическим методом

 

 

Принцип метода: С-реактивный белок (СРБ) сыворотки взаимодействует с моноспецифическими антителами, присутствующими в избытке в реакционной смеси с образованием преципитата, усиленного ПЭГ.

Турбидиметрическое определение концентрации СРБ основано на регистрации оптической плотности анализируемой пробы при длине волны 340 нм.

 

Диапазон измерения метода: 8-150 мг/л.

Норма: до 10 мг/л (37°С);

 

СРБ в сыворотке сохраняет стабильность при замораживании (-20°С) в течение 6 месяцев.

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 340 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 75 мкл, 200 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови негемолизированная / плазма;

5) СРБ-буфер (ТРИС-буфер 0,01 моль/л, содержащий 5% ПЭГ);

6) Антисыворотка против СРБ;

7) Калибровочные растворы №№ 1-5 с указанной на этикетках концентрацией СРБ;

8) Физиологический раствор (хлорид натрия 0,9%).

Антисыворотка разводится в 3 раза (1:2) СРБ буфером с ПЭГ (полиэтиленгликолем). Разведенная антисыворотка годна для применения при условии хранения его при температуре 2-8°С в течение 30 дней.

 

Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37°С).

 

Добавить в кювету	Холостая проба	Опытная проба	Стандартная проба
1. Стандарт	--	--	75 мкл
2. Сыворотка	--	75 мкл	--
3. Буфер для СРБ	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать в течение 15 с. Инкубировать 10 минут при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность холостой пробы.
4. Антисыворотка против СРБ	--	200 мкл	200 мкл

 

Перемешивать содержимое пробирок в течение 15 секунд. Измерить оптическую плотность проб при длине 340 нм ровно через 5 минут после добавления антисыворотки.

 

Расчет

Расчет концентрации СРБ проводят по нелинейной калибровочной кривой:

 

№ стандар-та	Оптическая плотность при 340 нм	№ стандар-та	Оптическая плотность при 340 нм
Стандарт 1		Стандарт 4
Стандарт 2		Стандарт 5
Стандарт 3

 

Если концентрация СРБ пробы выше самой высокой концентрации стандартного раствора СРБ (точка вне рабочей зоны калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:4 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат умножить на 5.

 

Клинико-диагностическое значение: СРБ – это a₂-глобулин и компонент неспецифического иммунного ответа на ранних стадиях проникновения антигена в организм. СРБ способствует удалению из крови эндогенных веществ, образующихся в результате разрушения клеток организма (полисахариды, гликопротеины, нуклеиновые кислоты, фосфатидилхолин и пр.).

СРБ относится к белкам острой фазы. При тяжелых воспалениях синтез его в печени возрастает более, чем в тысячу раз. Уровень СРБ в крови увеличивается в течение 6-10 часов в реакциях острой фазы (разрушение тканей, воспаление).

Концентрация СРБ у курильщиков может достигать 25 мг/л. После хирургического вмешательства (если нет осложнений) СРБ держится в течение 2 дней на уровне до 150 мг/л, а затем возвращается в норму.

Плохим прогностическим признаком является СРБ > 200 мг/л на протяжении 10 дней и более после хирургического вмешательства. За 1-2 дня до летального исхода СРБ заметно увеличивается.

Определение концентрации СРБ используют для отличия бактериальных инфекций от вирусных. Концентрация СРБ до 50 мг/л обычно наблюдается при легких вирусных инфекциях и местных бактериальных инфекциях; 50-150 мг/л – в основном при бактериальных инфекциях и в отдельных случаях при тяжелых вирусных инфекциях; > 150 мг/л – при тяжелых бактериальных инфекциях.

Максимальная концентрация СРБ может доходить до 400 мг/л у новорожденных и примерно до 850 мг/л у взрослых.

 

Лабораторная работа № 19.

Определение компонентов мочи с помощью диагностических полосок (HUMAN-Test Combina)

Принцип метода: В основе работы тест-полосок лежат методы сухой химии. Полоски предназначены для полуколичественного определения компонентов мочи по результатам цветных и ферментативных реакций в толще полоски.

Интенсивность окраски тестовой области полоски сравнивается с цветовой шкалой для каждого компонента.

Оборудование и реагенты:

1) Тест-полоски;

2) Свежесобранная моча;

3) Цветовые шкалы для показателей на этикетке контейнера для тест-полосок.

Проведение анализа

1. Погрузить полоску в мочу на 1-2 секунды так, чтобы намочить все тестовые области.

2. Удалить излишек мочи с полоски проведя ею по краю емкости с мочой.

3. Держать полоску горизонтально в течение 1-2 минут.

4. Сравнить цвета всех тестовых областей полоски с соответствующими цветовыми шкалами на этикетке контейнера. Сравнение должно проводится не позднее, чем через 2 минуты! Цвет на краях тестовых областей не учитывается.

 

Компо-нент мочи	Принцип метода	Результат	Норма	Клинико-диагностическое значение
1. Удель-ный вес	Ионный обмен между электролитом тестовой области и ионами, растворенными в моче, что вызывает изменение окраски индикатора.	Сине-зеленый цвет для низкой ионной силы до желто-коричневого цвета для концентрированной мочи.	³ 1,018 для утренней мочи. Удельный вес зависит от концентра-ции растворен-ных в моче веществ.	Очень высокие и низкие цифры плотности для утренней мочи требуют установления причины. Низкий удельный вес обычно связан с полиурией, а высокий чаще бывает при глюкозуриях.
2. Нитриты	Реакция Грисса: сульфаниламид стетрагидробензо-хинолином реагируют с продуктами метаболизма энтеробактерий.	Любая степень окраски в оранжево-розовый цвет свидетельствует о присутствии не менее 10^5 микроорганизмов в 1 мл мочи	< 10^3 микроорга-низмов в мл мочи	Определенная степень бактериурии указывает на наличие воспалительного процесса. Отрицательный результат не исключает бактериурии и может говорить об инфицировании бактериями, не содержащими нитрат-редуктазы
3. рН	Двойной индикатор: метиловый красный и бромтимоловый синий	Диапазон окраски от оранжевого через желтый и зеленый до синего, что соответствует рН от 5 до 9.	рН свежей мочи находится в диапазоне 5-6	При смешанной пище в организме образуются кислые продукты обмена. Кислотность увеличивается при сахарном диабете, туберкулезе почек и почечной недостаточности. Щелочная реакция мочи характерна при рвоте, приеме щелочных лекарств, хронической инфекции мочевыводящих путей
4. Белок/ альбумин	Сдвиг рН индикатора тетрабромфеноло-вого синего, чувствительный к альбумину	При выраженной протеинурии окраска соответствует содержанию белка > 0,3 г/л	Ниже порога чувстви-тельности теста	Белок в моче появляется при усиленном распаде белка тканей, при гемолизе, при патологии почек, при воспалении мочевыводящих путей.
5. Глюкоза	Ферментативный глюкозооксидазный метод, специфичный для глюкозы	Зеленоватый оттенок тестовой области свидетельствует о небольших количествах глюкозы в моче	Глюкоз урия до 0,2 г/л не обнаружи-вается	Появление глюкозы в моче зависит от ее концентрации в крови, от фильтрационной способности почек и от реабсорбционных процессах в канальцах нефрона. Глюкоза появляется также при раздраждении ЦНС, гипертиреозе, патологии печени. Глюкозурия может иметь алиментарную и лекарственную причины.
6.Кетоны	Взаимодействие ацетона и ацетоуксусной кислоты с нитропруссидом натрия в щелочной среде (тест Легаля)	При наличии кетонов образуется комплекс фиолетового цвета. Красное окрашивание может быть вызвано наличием фталеиновых соединений	Отсутству-ют в моче	Появление кетонов в моче может быть вызвано физиологическим стрессом (голодание, беременность, спорт), но чаще наблюдается при диабете и свидетельствует о неправильном пищевом режиме.
7. Уроби-линоген	Реакция связывания уробилиногена стабилизированными солями диазония	Желтая окраска тестовой области с последующим переходом в зелено-голубой цвет	1,7-30 мкмоль/л	Паталогическая концентрация уробилиногена – характерный симптом поражения паренхимы печени (гепатиты, цирроз), гемолитических состояний и заболеваний кишечника (энтериты, запоры, кишечная непроходимость). Полное отсутствие говорит о нарушении поступления желчи в кишечник.
8. Билиру-бин	Связывание билирубина со стабилизированны-ми солями диазония в сильнокислой среде	Желто-оранжевая окраска тестовой области	Отсутству-ет в моче	Следовые количества билирубина свидетельствуют о ранних заболеваниях печени и нарушении оттока желчи и требуют дальнейшего обследования.

 

 

Клинико-диагностическое значение: Тест-полоски предназначены для скрининговых исследований мочи в целях диагностики диабета, заболеваний печени, гемолитических болезней, урогенитальной и почечной патологии, а также нарушений метаболизма и кислотно-щелочного баланса.