РГА с аллантоисной жидкостью куриных эмбрионов, зараженных вирусом гриппа

Принцип метода _______________________________________________________________________________

Исследуемый материал _________________________________________________________________________

Дополнительные ингредиенты реакции ____________________________________________________________

Разведение вируса	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	Контроль эритроцитов
1 кап. взвеси КЭ
Результат

Вывод: _______________________________________________________________________________________

2) Культура клеток

Первичные культуры клеток

Перевиваемые культуры клеток

Это клетки различного типа (почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов). Срок жизни таких культур ограничен ≤ 10 пересевами. Лишь отдельные группы клеток первичных культур могут сохранить способность к росту и размножению и при многократных пересевах они дают начало перевиваемым культурам клеток.

Перевиваемые клеточные линиии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным набором хромосом. Наиболее часто применяются такие линии перевиваемых клеток как RH - из почки человека; ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки, Vero – из почек зеленой мартышки и др. Полуперевиваемые культуры клеток (диплоидные) - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать максимум 50 пассажей, сохраняя при этом свою исходную морфологию и диплоидный набор хромосом.

Питательные среды и солевые растворы для культур

- Буферные солевые растворы применяются для промывки тканей и клеток в процессе приготовления клеточных культур и для приготовления питательных сред.

- Питательные среды по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие.

Широкое применение находят синтетические стандартные питательные среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначе­ния все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. В состав ростовых сред входит сыворотка крови животных.

 

Выделение вирусов и методы их индикации в культуре клеток

Для заражения используются чувствительные к данному вирусу культуры с хорошо развитым монослоем клеток, находящиеся в пробирках (флаконах).

Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку (лунку планшета или флакон) вносят по 0,1-0,2мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками. После 30 - 60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят по 1,0 - 1,5мл на пробирку поддерживающей среды и оставляют в термостате до выявления признаков репродукции вирусов.

 

ФЕНОМЕНЫ, ПОЗВОЛЯЮЩИЕ ВЫЯВИТЬ ВИРУС В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК

1. Цитопатический эффект (действие) – (ЦПЭ или ЦПД), который является следствием поражения клеток под действием размножающегося в них вируса.

ЦПД может быть трех основных типов:

а) кругло- или мелкоклеточная дегенерация;

б) образование гигантских многоядерных клеток - симпластообразование;

в) образование внутриядерных или цитоплазматических включений вирусспецифических или неспецифических.

Феномен гемадсорбции (РГадс)

Принцип метода: контакт клеток с эритроцитами приводит к адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, пораженных вирусом с гемагглютинирующими свойствами. Эффект можно увидеть при малом увеличении микроскопа (х80).

положительная

отрицательная

 

Образование бляшек - феномен Дюльбекко

Принцип метода: монослой клеток после заражения вирусомзаливаютслоем полужидкого агара, в состав которого входит питательная среда и краситель нейтральный красный. В тех зонах монослоя, где происходит размножение цитопатического вируса, группы разрушенных клеток не закисляют среду, выглядят на розовом фоне прозрачными пятнами.

Феномен интерференции

Принцип метода: феномен интерференции используется для обнаружения вирусов, не дающих отчетливого ЦПД в культуре клеток. Исследуемую культуру повторно заражают вирусом, регулярно вызывающим ЦПД. Индикаторным является ВВС - вирус везикулярного стоматита. При наличии в исследуемом материале нецитопатогенного вируса ЦПД у индикаторного ВВС также будет отсутствовать (клетка "занята" исследуемым вирусом).

 

3) ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ

Используют преимущественно новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражение животных проводится по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные - интрацеребрально, дерматотропные - на кожу. Индикация вируса основана на проявлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических изменениях в тканях и органах, а также на положительной реакции гемагглютинации с экстрактами из органов.

 

СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД.

а). Для ранней диагностики заболевания определяют наличие IgM в сыворотке с помощью ИФА или непрямой РИФ.

б). В серодиагностике вирусных инфекций используют подход «парных сывороток», что позволяет определить нарастание титра (прирост антител) за определенный период заболевания с помощью набора вирусных диагностикумов. Парные сыворотки - две сыворотки, взятые от одного больного в начале заболевания и через 1-4 недели. Серологические реакции (РПГА, РСК, РТГА, РН, ИФА и др.) ставят одновременно с двумя сыворотками для определения и сравнения их титров.

Диагностически значимым считают нарастание титра в 4 и более раз.

 

ОСНОВНЫЕ СЕМЕЙСТВА ВИРУСОВ (контрольная)

ДНК- содержащие

Простые (без оболочек) ДНК- содержащие вирусы 1.Аденовирусы Adenoviridae 2-х нитчатая ДНК 2.Папилломавирусы Papillomaviridae 2-х нитчатая ДНК 3.Полиомавирусы Poliomaviridae 2-х нитчатая ДНК 4. Цирциновирусы Circinoviridae 1- нитчатая ДНК 5.Парвовирусы Parvoviridae 1- нитчатая ДНК

Сложные (с оболочками) ДНК- содерж. вирусы * Поксвирусы Poxviridae 2-х нитчатая ДНК * Герпесвирусы Herpesviridae 2-х нитчатая ДНК * Гепаднавирусы Hepadnaviridae 2-х нитчатая кольцевая ДНК с 1 нитчатым участком

РНК- содержащие

Простые (без оболочек) РНК- содержащие вирусы 1.Пикорнавирусы Picornaviridae 1-нитчатая РНК 2.Калицивирусы - Caliciviridae - 1-нитчатая РНК 3.Астровирусы - Astroviridae - 1-нитчатая РНК 4.Реовирусы - Reoviridae - 2-нитчатая РНК фрагментированная

Сложные (с оболочками) РНК- содержащие вирусы *Ортомиксовирусы Orthоmyxoviridae 1-нитч.РНК *Парамиксовирусы Paramyxoviridae 1-нитч. РНК *Тогавирусы Togaviridae 1-нитчатая РНК *Рабдовирусы Rhabdoviridae 1-нитчатая РНК *Филовирусы Filoviridae 1-нитчатая РНК *Флавивирусы Flaviviridae 1-нитчатая РНК *Ретровирусы Retroviridae 1-нитчатая РНК *Аренавирусы Arenaviridae 1-нитчатая РНК *Коронавирусы Coronaviridae 1-нитчатая РНК *Буньявирусы Bunyаviridae 1-нитчатая РНК

 

ДЕМОНСТРАЦИИ

Среды для культивирования клеток: среда 199, раствор Хенкса, сыворотка, гидролизат лактальбумина, трипсин, раствор Версена, лейкоцитарный интерферон.

ЗАНЯТИЕ № 28