Определение фаготипа (при стафилококковых инфекциях).

Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий.

Цели фаготипиривания:

1. Помощь эпидемиологу в выявлении источников и путей циркуляции инфекции при внутрибольничном заражении;

2. Для идентификации микроба.

Определение фаготипа стафилококка проводят при помощи фагов, разведенных до тест- разведения, обозначенного на этикетке. Каплю 4-х часовой бульонной культуры распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18 часов при температуре 37^оС. На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который в тест-разведении вызывает её полный лизис. В зависимости от чувствительности культуры к фагу наблюдается разная степень лизиса:

+ + + + - сплошной лизис

+ + + - сливной лизис с вторичным ростом

+ + - более 50 негативных колоний (стерильных пятен)

+ - единичные негативные колонии (стерильные пятна)

- лизиса нет

Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа).

 

Реакция фаголизиса.

Реакция фаголизиса ставится для идентификации возбудителя дизентерии.

Постановка реакции:

1) чистая культура шигелл на скошенном агаре;

2) 2 пробирки с МПБ – «опыт» и «контроль»;

3) дизентерийный бактериофаг

На I этапе:

1) Проверка культуры шигелл на чистоту (окраска по Граму);

2) Посев в 2 пробирки с МПБ

3) В пробирку «опыт» добавить 2 капли (0,1 мл) дизентерийного бактериофага;

4) Посевы инкубировать в термостате 18-20 часов при темпратуре 37^оС

На II этапе:

1) Регистрация результатов посева

В пробирке «контроль» имеется равномерное помутнение МПБ, т.к. культура шигелл оказалась жизнеспособной. В пробирке «опыт» МПБ прозрачный, т.е. дизентерийный бактериофаг вызвал лизис одноименной культуры бактерий.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

При ИФА в качестве метки применяют ферменты. Используется в диагностике СПИДа и вирусных гепатитов. Иммуноферментная система «Гепа Стрип» предназначена для выявления поверхностного HbsAg антигена вируса гепатита В.

Компоненты:

1. Полистироловый планшет;

2. Антитела к HbsAg;

3. Конъюгат – мышиные моноклониальные антитела, меченые пероксидазой;

4. Контрольные сыворотки;

5. Фосфатно-солевой буфер;

6. Ортофенилдиамин (ОФД).

Реакция протекает в две фазы. HbsAg связывается с гомологичными антителами, меченными пероксидазой. Затем ставят цветную реакцию с использованием ОФД, происходит желтое окрашивание.

Учет ИФА – по оптической плотности с помощью фотометра, при этом степень оптической плотности будет обратно пропорциональна концентрации HbsAg антигена вируса гепатита В.

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция имитирует естественную репликацию ДНК и позволяет обнаружить единственную молекулу ДНК в присутствии других молекул.

Суть метода заключается в размножении в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле вновь синтезированные молекулы копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное удвоение специфических фрагментов ДНК. Термостабильная ДНК-полимераза, полученная из термофильных бактерий, служит катализатором ПЦР.

В ПЦР участвуют праймеры – две искусственно синтезированные молекулы ДНК, которые комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента. Синтез протекает только между праймерами, и количество копий фрагмента удваивается.

Этапы цикла амплификации:

1. Денатурация ДНК при t=95^оС 1 мин.

2. Отжиг (присоединение) праймеров, t=50-65^оС 1-2 мин.

3. Синтез фрагмента ДНК, t=72^оС 1-3 мин.

Продукты синтеза первого цикла амплификации служат матрицей для второго цикла, а продукты синтеза второго цикла – матрицей для третьего цикла амплификации. Цикл амплификации проводится в термо-циклере или амплификаторе. За 30 циклов амплификации образуется 10 копий специфического фрагмента.

Достоинства ПЦР:

1) высокая чувствительность и специфичность;

2) быстрота;

3) возможность диагностики внутриклеточных паразитов и персистирующих микроорганизмов;

4) использование клинического материала, взятого от больного.

 

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Использование при диагностике гриппа

Реакция относится к серологическим реакциям с участием меченых антигенов или антител.

Проводится прямым и непрямым методами.

При прямом методе обнаруживают антиген в материале от больного. Используется диагностическая флюоресцирующая сыворотка, которая содержит иммуноглобулины, выделенные из иммунных сывороток и меченные флюорохромами.

Специфический антиген обнаруживается в виде ярко-зеленых люминесцирующих конгломератов, а фон препарата окрашивается в оранжево-красный цвет.

Компоненты реакции прямой иммунофлюоресценции:

Для поиска антигена при экспресс-диагностике:

1) исследуемый материал;

2) специфическая люминесцентная сыворотка;

3) люминесцентный микроскоп.

При диагностике гриппа проводят дифференциацию от возбудителей парагриппа и аденовирусной инфекции. Носоглоточный мазок обрабатывают флюоресцирующей гриппозной сывороткой или гриппозным иммуноглобулином.

«+» результат в виде зеленого свечения получают через 3 часа.

При непрямом методе проводят обнаружение и титрование специфических антител. Титром сыворотки называется ее максимальное разведение, при котором отмечается флюоресценция на «+ +».

Компоненты реакции непрямой иммунофлюоресценции

Для поиска антигена при экспресс-диагностике:

1) исследуемый материал (антиген);

2) специфическая сыворотка;

3) антиглобулиновая люминесцентная сыворотка

4) люминесцентный микроскоп.

I фаза специфическая

Сывороточные антитела адсорбируются на антигене.

II фаза неспецифическая

Используется антиглобулиновая сыворотка с антителами, меченными флюорохромами. Образуется комплекс антиген+антитело (I) + антиглобулиновая сыворотка (II), который светится.

 

32. РПГА для определения напряженности противодифтерийного поствакцинального иммунитета

Антитоксический противодифтерийный иммунитет проверяют с помощью РПГА с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом (анатоксином).

Неимунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мг

Ингредиенты:

1. Испытуемая сыворотка, адсорбированная бараньими эритроцитами;

2. Эритроцтарный диагностикум;

3. Физиологический раствор;

4. Противодифтерийная контрольная сыворотка активностью 10 МЕ.

Постановка реакции:

1) Сыворотку разводят физиологическим раствором в 12 лунках от 1:10 до 1:20480 (1:40-1:5120)

2) В каждую лунку добавляют по 1 капле диагностикума;

3) Противодифтерийную контрольную сыворотку разводят также от 1:10 до 1:20480 и вносят по 1 капле диагностикума;

4) Оставляют на 3 часа при комнатной температуре.

10хА

Расчет активности: Х=-----------, где

В

Х – активность испытуемой сыворотки;

10 – титр контрольной сыворотки;

А – максимальное разведение испытуемой сыворотки с положительным результатом;

В – максимальное разведение контрольной сыворотки с положительным результатом.

 

Реакция флокуляции

Протекает in vitro (в пробирке) при эквивалентном соотношении антигена и антитела. Сопровождается помутнением и выпадением осадка. Феномен флокуляции используют:

- для определения флоккулирующей активности токсинов;

- для титрования антитоксических сывороток.

Например, при дифтерии используется реакция флокуляции с дифтерийным анатоксином. В пробирке, где количество сыворотки и анатоксина эквивалентно, выпадают нежные хлопья. Количество анатоксина, дающее в смеси 1 АЕ сыворотки инициальную флокуляцию, называется 1 иммуногенной единицей анатоксина (1 ИЕ).