Определение агрегационных свойств тромбоцитов

 

 

Работа 3. Исследование агрегации тромбоцитов. Агрегаци- онные свойства тромбоцитов изучают с помощью анализатора агрегации тромбоцитов. Проба служит для оценки сосудисто- тромбоцитарного гемостаза. Агрегатометрия является незамени- мым методом в клинической и экспериментальной научно- исследовательской работе для изучения влияния на тромбоциты различных соединений и фармакологических препаратов, а также для исследования механизмов агрегации.

Принцип метода заключается в регистрации агрегации

тромбоцитов в результате активации данного процесса добавле-

нием индуктора агрегации (АДФ, коллаген, адреналин и др.) к

Кровь для исследования рекомендуется брать утром нато- щак пункцией иглой локтевой вены (самотеком). Свертывание крови предупреждается 3,8%-м раствором цитрата натрия, добав- ляемом в соотношении 1:9. Для исключения контактной актива- ции тромбоцитов в работе используется только пластмассовая или силиконированная посуда (кюветы, пробирки, пипетки). Вначале кровь центрифугируют при малых оборотах (15 мин при 1000 об/мин.). При этом отделяется богатая тромбоцитами плаз- ма, которая отбирается в пластмассовые пробирки. Затем остав- шуюся кровь снова центрифугируют, но уже при более высоких оборотах (15 мин при 3000 об./мин.). Образующийся после по-

плазме, обогащенной тромбоцитами.

 

вторного центрифугирования верхний слой является бестромбо-
цитной плазмой. Плазма, богатая тромбоцитами, используется
для исследования их функциональной активности, бестромбо-
цитная плазма – для калибровки шкалы оптической плотности
прибора, и, при необходимости, для разведения богатой тромбо-
цитами плазмы до стандартного содержания клеток, которое
должно составлять (200-250)х109/л.
При исследовании агрегации тромбоцитов in vitro индуктор
агрегации (АДФ, адреналин (эпинефрин), норадреналин (норэпи-
нефрин), коллаген, ристомицин (ристоцитин, аггристин), тром-
бин, арахидоновая кислота, серотонин, фактор VIII крупного ро-
гатого скота, Са2+-ионофор, тромбоксан А2) прибавляется к плаз-
ме, богатой тромбоцитами.
Мерой агрегационного процесса является графически реги-
стрируемое падение оптической плотности плазмы крови в ре-
зультате потребления тромбоцитов в агрегатах, образующихся
под воздействием индукторов агрегации (рис.86).

 

Рис. 86. Принцип работы агрегометра

 

 

Первой ответной реакцией на добавление индуктора агрега-

ции является изменение формы тромбоцитов, набухание (shape

change), их дискоидная форма переходит в сферическую. В этот

момент на агрегатограмме может отмечаться кратковременный

сдвиг исходной оптической плотности в сторону увеличения. За

изменением формы тромбоцитов наступает первая фаза агрега-

ции (первичная агрегация), вызываемая агрегационным средст-

вом. Кривая агрегации смещается в сторону снижения оптиче-

 

 

 

ской плотности. После окончания первичной агрегации крутизна
агрегационной кривой понижается (lag phase), за этот период из
тромбоцитов освобождаются (реакция освобождения) секрети-
руемые в гранулах биологически активные соединения (АДФ, се-
ротонин, тромбоксаны и пр.), вызывающие новую агрегационную
волну (вторичная агрегация, вторая фаза агрегации) (рис. 87–89).
Ось абсцисс соответствует времени измерения, ось ординат
– процентам светопропускания плазмы (уровню агрегации). Чи-
словые поля внизу окна отражают время измерения, уровень аг-
регации в текущий момент времени и измеренную концентрацию
тромбоцитов.
К параметрам агрегации относятся:
степеньагрегации – максимальный уровень светопро-
пускания плазмы после внесения индуктора агрегации, %;
времяагрегации – время, соответствующее максималь-
ной степени агрегации с момента внесения индуктора агрегации,
мин/сек;
скорость агрегации – изменение светопропускания
плазмы (%/ мин) после внесения индуктора агрегации. Измеряет-
ся на отрезке длиной 30 секунд (по оси абсцисс) от точки отсчета.

 

Рис. 87. Агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ в дозе 0,5×10-6 М.

Нормальная кривая. Первичная агрегация с дезагрегацией

 

Рис. 88. Агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ в дозе 1,5×10-6М.

Нормальная кривая. Двухфазная агрегация

 

 

Рис. 89. Патологические кривые агрегации тромбоцитов

 

 

Определение ретракции кровяного сгустка

В основе метода лежит определение объема сыворотки через

час после образования сгустка.

В норме ретракция кровяного сгустка колеблется в пределах

48-60%.

 

Недостаточная ретракция сгустка наблюдается при выражен-

ных тромбоцитопениях, а также при некоторых тромбоцитопати-

ях. Ложное уменьшение ретракции имеет место при избытке

эритроцитов – истинной полицитемии, ложное увеличение – при

анемиях, при гипофибринемии.

 

Таблица 18. Оценка первичного гемостаза у детей

(Иванов Е.П., 1983, 1991)

 

Тесты	Зона кровото- чивости	Норма	Зона тромбообра- зования
Количество тромбоцитов, х109/л	<100	160-	>450
Длительность кровотече- ния по Дуке, мин.	>4	2-4	-
Адгезия тромбоцитов, % <20 30-40 >40
Агрегация тромбоцитов, %	<20	30-40	>40
Резистентность капилля- ров, количество петехий по манжеточной пробе.	>5		-