Глава 3 пoлученные результаты и иx oбcуждение

3.1 Анализ геномного сиквенса Azosprillum thiophilum BV-S^T

Анализ полного секвенированного генома A. thiophilum показал, что геном содержит полный набор генов, кодирующий ферменты цикла Кальвина-Бенсона-Бэссема. (рис. 1, табл. 1). Ген, кодирующий седогептулозо-1,7-бифосфатазу, у A. thiophilum не был выявлен. Следует заметить, что эта ферментативная активность в бактериях часто катализируется фруктозо-1,6-бифосфатазой с двойной специфичностью к сахарам [10]. В геноме A. thiophilum такжебыл обнаружен ген, кодирующий рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазу IV типа.

Рис 1. Организация генов Azospirillum thiophilum BV-S^T, кодирующих ферменты восстановительного пентозофосфатного цикла (цикла Кальвина-Бенсона-Бэссема), их расположение в хромосомах. Хромосома 1: pgk - Фосфоглицерат-киназа (КФ: 2.7.2.3); fbaB - Фруктозо-бисфосфат-альдолаза, класс II (КФ: 4.1.2.13); gapA - НАДФН-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (КФ: 1.2.1.12)/ НАД-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (КФ: 1.2.1.12); tktA - Транскетолаза (КФ: 2.2.1.1); glpX - Фруктозо-1,6-бисфосфатаза, тип II (КФ: 3.1.3.11); rpe - Рибулозо-фосфат-3-эпимераза (КФ: 5.1.3.1). Хромосома 2: cbbR - Оперон РБФК, транскрипционный регулятор CbbR; rbcL - Рибулозо-бисфосфат-карбоксилаза, большая цепь (КФ: 4.1.1.39); rbcS - Рибулозо-бисфосфат-карбоксилаза, малая цепь (КФ: 4.1.1.39); cbbX - Белок CbbX, регулирующий экспрессию РБФК; fbp - Фруктозо-1,6-бисфосфатаза, тип I (КФ: 3.1.3.11); prkB - Фосфорибулокиназа (КФ: 2.7.1.19); fbaA - Фруктозо-бисфосфат-альдолаза, класс II (КФ: 4.1.2.13).

 

Гены, кодирующие ферменты цикла Кальвина-Бенсона-Бэссема (pgk, fba, gapA, tktA, rpiA, rpe, tpiA, cbbR, rbcL, rbcS, cbbX, fbp, prkB, fbaA), не образуют в геноме единого кластера, а находятся в трех хромосомах (1, 2 и 5). Большинство этих генов закодированы в первой и во второй хромосомах. Большая часть ферментов представлена в геноме в одной копии, однако НАДФН-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (КФ: 1.2.1.12)/ НАД-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (КФ: 1.2.1.12) представлена двумя копиями гена gapA, расположенными в первой и пятой хромосомах, а транскетолаза - тремя, две копии гена tktA расположены в первой хромосоме, а третья – во второй.

Таблица 1.

Гены Azospirillum thiophilum BV-S^T_, кодирующие ферменты

цикла Кальвина-Бенсона-Бэссема.

№ гена в генбанке	Название фермента	Ген
locus_tag="AL072 _16565"	Оперон РБФК, транскрипционный регулятор CbbR	CbbR
WP_045583125.1	Фосфорибулокиназа (КФ: 2.7.1.19)	prkB
WP_045586150.1WP_045583128.1	Рибулозо-бисфосфат-карбоксилаза, большая цепь (КФ: 4.1.1.39)	rbcL
WP_045583127.1	Рибулозо-бисфосфат-карбоксилаза, малая цепь (КФ: 4.1.1.39)	rbcS
WP_045583407.1	Белок CbbX, регулирующий экспрессию РБФК	cbbX
WP_045581729.1	Фосфоглицерат-киназа (КФ: 2.7.2.3)	pgk
WP_045582217.1	Триозофосфат-изомераза (КФ: 5.3.1.1)	tpi
WP_045585897.1WP_045580598.1	НАДФН-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (КФ: 1.2.1.12)/ НАД-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (КФ: 1.2.1.12)	gapA
WP_045583124.1	Фруктозо-бисфосфат-альдолаза, класс II (КФ: 4.1.2.13)	fbaA
WP_045580602.1	Фруктозо-бисфосфат-альдолаза, класс I (КФ:4.1.2.13)	fbaB
WP_045583126.1	Фруктозо-1,6-бисфосфатаза, тип I (КФ: 3.1.3.11)	fbp
WP_045580455.1	Фруктозо-1,6-бисфосфатаза, тип II (КФ: 3.1.3.11)	glpX
WP_045585730.1WP_045583406.1WP_045580597.1	Транскетолаза (КФ: 2.2.1.1)	tktA
WP_045580562.1	Рибозо-5-фосфат-изомераза A (КФ: 5.3.1.6)	rpiA
WP_045580080.1	Рибулозо-фосфат-3-эпимераза (КФ: 5.1.3.1)	rpe

3.2. Активность ферментов, участвующих в фиксации СО₂

Для экспериментального подтверждения функционирования цикла Кальвина-Бенсона-Бэссема, выяснения активности некоторых ферментов, вовлеченных в ассимиляцию и восстановление CO₂ культуру выращивали в автотрофных условиях.

При автотрофном росте A. thiophilum нами была показана высокая активность фосфорибулокиназы (prkB), одного из ключевых ферментов цикла Кальвина, которая при автотрофном росте A. thiophilum составила 2,5±0,13 мкмоль∙мин^-1∙мг белка^-1, тогда как при гетеротрофном росте активность фермента определить не удалось.

Активность карбоангидразы, участвующей в превращении бикарбонатного иона (HCO₃^-) в CО₂, непосредственно взаимодействующего с РБФК, при литоавтотрофном росте составила 19,6±1 у.е., что значительно превышает данные об активности при литогетеротрофном росте, которая составили 3,3±0,17 у.е.

 

3.3. Экспрессия гена rbcL большой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы

В связи с тем, что РБФК является ключевым ферментом цикла Кальвина, для подтверждения возможности функционирования цикла Кальвина у A. thiophilum, был проверен уровень экспрессии гена rbcL, кодирующего большую субъединицу РБФК, при росте культуры в авто- и гетеротрофных условиях.

Изучение экспрессии генов осуществляли методом кПЦР на приборе CFX96 (Bio-Rad, США). В качестве референсного гена использовали фрагмент гена 16SрРНК. Для гена rbcL были подобраны праймеры при помощи primerBLAST: RbcL_F2: AACCCAAGGACACCGACATC и RbcL_R2: GGTCTTCAGATAGGCGACCG. Электрофорез в 2% агарозном геле показал специфичный характер подобранных нами праймеров. Был выявлен только один продукт амплификации, длина которого соответствовала теоретически предсказанной (рис. 2Б). С использованием метода qPCR было показано, что экспрессия RbcL в автотрофных условиях в 7,67 раз выше, чем в гетеротрофных (рис. 2А).

 

Рис. 2. (А) Экспрессии гена rbcL при (1) автотрофном и (2) гетеротрофном культивировании и (Б) амплификация фрагмента гена rbcL с парой праймеров RbcL_F2/RbcL_R2 (длина целевого продукта 353 нуклеотида).

 

3.4. Литоавтотрофный рост в присутствии тиосульфата и NaHCO₃

Проводились четыре последовательных пассажа в течение которых A. thiophilum культивировали на питательной среде, содержащей в качестве донора электронов тиосульфат и единственного источника углерода NaHCO₃ (рис. 3).

На протяжении первых двух пассажей наблюдалось резкое уменьшение биомассы клеток, вследствие уменьшения содержания органических веществ, пептона и сукцината, в среде. В третьем и четвертом пассаже количество биомассы стабилизировалось, так как органические соединения исчерпались и бактерии росли только за счет СО₂. В связи с этим последний пассаж считали самым достоверным. Прирост биомассы в четвертом пассаже составил 9,1*10⁶ кл/мл среды.

 

Рис. 3. Прирост биомассы (кл/мл) A. thiophilum при литоавтотрорфном росте.

 

Автотрофный рост у A. thiophilum сопровождался окислением тиосульфата (табл. 2).

 

 

Таблица 2.

Динамика окисления тиосульфата и прирост биомассы клеток A. thiophilum при литоавтотрофном росте в присутствии тиосульфата

Пассаж	Количество клеток/ мл	S/S2O3-2 мг/л	Нмоль S2O3-2 /мл	нмоль S2O3-2 /кл
I	47,5 ± 2,3		4,40	0,09
II	16 ± 0,8		3,00	0,19
III	15,39 ± 0,7		2,80	0,18
IV	9,1 ± 0,5		2,25	0,25

 

Из таблицы следует, что нмоль окисленного тиосульфата на количество клеток возрастает по мере снижения концентрации органических соединений, т. е. величины эффективности использования энергетического субстрата (тиосульфата) к четвертому пассажу, когда исчерпан органический субстрат, возрастают в 2,7 раза. Эти данные подтверждают возможность литоавтотрофного роста у A. thiophilum.

 

ВЫВОДЫ

 

1. На основании анализа геномного сиквенса было установлено, что автотрофная ассимиляция CO₂ у Azosprillum thiophilum осуществляется посредством цикла Кальвина-Бенсона-Бэссема. Был обнаружен полный набор генов, кодирующий ферменты цикла.

2. Показана активность фосфорибулокиназы, одного из ключевых ферментов цикла Кальвина-Бенсона-Бэссема, и карбоангидразы, участвующего в превращении бикарбонатного иона () в CO₂, непосредственно взаимодействующего с РБФК, при литоавтотрофном росте. Активность фосфорибулокиназы составила 2,5 мкмоль мин^-1 мг белка^-1, активность карбоангидразы – 19,6 у.е.

3. Показана экспрессия гена большой субъединицы РБФК. В результате анализа геномного сиквенса установлено наличие у этой бактерии I и IV форм РБФК.

4. Показан стабильный литоавтотрофный рост в течение четырех пассажей в присутствии тиосульфата и соды. Величины эффективности использования энергетического субстрата (тиосульфата) к четвертому пассажу, когда исчерпан органический субстрат, возрастают в 2,7 раза. Эти данные подтверждают возможность литоавтотрофного роста у A. thiophilum.

 

 

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Резников А.А. Методы анализа природных вод / А.А. Резников, Е.П. Муликовская, В.Ю. Соколов. - М.: Госгеолтехиздат, 1970. – 488 c.

2. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов / А.К. Романова. - М.: Наука, 1980. - 160 с.

3. Турова Т. П. Филогения и эволюция генов Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у прокариот / Т. П. Турова, Е. М. Спиридонова // Молекулярная биология. – 2009. – Т. 43, вып. 5. – С. 772-788.

4. Andersson, I. Large structures at high resolution: the 1.6 Å crystal structure of spinach ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase complexed with 2-carboxyarabinitol bisphosphate / I. Andersson // Journal of molecular biology. – 1996. – Vol. 259, №. 1. – P. 160-174.

5. Azospirillum thiophilum sp. nov., a diazotrophic bacterium isolated from a sulfide spring / K. Lavrinenko, E. Chernousova, E. Gridneva [et al.] // Int. J. of Syst. and Evol. Microbiol. – 2010. – Vol. 60. – P. 2832–2837.

6. Basic local alignment search tool / S. F. Altschul, Warren Gish, W. Miller [et al.] // Journal of molecular biology. – 1990. – Vol. 215, №. 3. – P. 403-410.

7. Boggetto, N. Regulation of phosphoribulokinase and glyceraldehyde 3‐phosphate dehydrogenase in a freshwater diatom, Asterionella formosa 1 / N. Boggetto, B. Gontero, S. C. Maberly // Journal of Phycology. – 2007. – Vol. 43, № 6. – P. 1227-1235.

8. Capacity of Azospirillum thiophilum for Lithotrophic Growth Coupled to Oxidation of Reduced Sulfur Compounds / E. N. Frolov, E. V. Belousova, K. S. Lavrinenko [et al.] // Microbiology. - 2013. - Vol. 82, № 3. - P.271-279.

9. Caraway, B. H. Aerotaxis in Spirillum volutans / B. H. Caraway, N. R. Krieg // Canadian Journal of Microbiology. – 1974. – Vol. 20, №. 10. – P. 1367-1377.

10. Chloroplast class I and class II aldolases are bifunctional for fructose-1, 6-biphosphate and sedoheptulose-1, 7-biphosphate cleavage in the Calvin cycle / A. Flechner, W. Gross, W.F. Martin, C. Schnarrenberger // FEBS letters. – 1999. – Vol. 447, №. 2. – P. 200-202.

11. Complete genome sequence of a strain of Azospirillum thiophilum isolated from a sulfide spring / A. Fomenkov, T. Vincze, M. Grabovich [et al.] // Genome announcements. – 2016. – Vol. 4, №. 1.

12. Discovery of a new family of carbonic anhydrases in the malaria pathogen Plasmodium falciparum —the η-carbonic anhydrases / S. Del Prete, D. Vullo, G. M. Fisher [et al.] // Bioorganic & medicinal chemistry letters. – 2014. – Vol. 24, №. 18. – P. 4389-4396.

13. Distinct form I, II, III, and IV Rubisco proteins from the three kingdoms of life provide clues about Rubisco evolution and structure/function relationships / F. R. Tabita, S. Satagopan, T. E. Hanson [et al.] // Journal of Experimental Botany. – 2008. – Vol. 59, № 7. – P. 1515-1524.

14. Dubbs, J. M. Regulators of nonsulfur purple phototrophic bacteria and the interactive control of CO2 assimilation, nitrogen fixation, hydrogen metabolism and energy generation / J. M. Dubbs, F. R. Tabita // FEMS microbiology reviews. – 2004. – Vol. 28, №. 3. – P. 353-376.

15. Extracellular carbonic anhydrases of the stromatolite-forming cyanobacterium Microcoleus chthonoplastes / E. Kupriyanova, A. Villarejo, A. Markelova [et al.] // Microbiology. – 2007. – Vol. 153, №. 4. – P. 1149-1156.

16. Fast induction of high-affinity HCO3− transport in cyanobacteria / D. Sültemeyer, В. Klughammer, М. R. Badger, G. D. Price // Plant Physiology. – 1998. – Vol. 116, №. 1. – P. 183-192.

17. Finn, M. W. Modified pathway to synthesize ribulose 1, 5-bisphosphate in methanogenic archaea / M. W. Finn, F. R. Tabita // Journal of bacteriology. – 2004. – Vol. 186, №. 19. – P. 6360-6366.

18. Finn, M. W. Synthesis of catalytically active form III ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in archaea / M. W. Finn, F. R. Tabita // Journal of bacteriology. – 2003. – Vol. 185, №. 10. – P. 3049-3059.

19. Function, Structure, and Evolution of the RubisCO-Like Proteins and Their RubisCO Homologs / F. Robert Tabita, Thomas E. Hanson, Huiying Li [et al.] // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2007. – Vol. 71, № 4. – P. 576-599.

20. Gibson, J. L. Organization of phosphoribulokinase and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase genes in Rhodopseudomonas (Rhodobacter) sphaeroides / J. L. Gibson, F. R. Tabita // Journal of bacteriology. – 1987. – Vol. 169, № 8. – P. 3685-3690.

21. Hanson, T. E. A ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RubisCO)-like protein from Chlorobium tepidum that is involved with sulfur metabolism and the response to oxidative stress / T. E. Hanson, F. R. Tabita // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2001. – Vol. 98, № 8. – P. 4397-4402.

22. Hartmann, A. Regulation of nitroge nase activity by oxygen in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum / A. Hartmann, R.H. Burris // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1987. – Vol. 169. – P. 944–948.

23. Igamberdiev, A. U. Feedforward non-Michaelis–Menten mechanism for CO 2 uptake by Rubisco: contribution of carbonic anhydrases and photorespiration to optimization of photosynthetic carbon assimilation / A. U. Igamberdiev, M. R. Roussel // Biosystems. – 2012. – Vol. 107, №. 3. – P. 158-166.

24. KAAS: an automatic genome annotation and pathway reconstruction server / Y. Moriya, M. Itoh, S. Okuda [et al.] // Nucleic acids research. – 2007. – Vol. 35, №. suppl 2. – P. W182-W185.

25. Knight, S. Crystallographic analysis of ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase from spinach at 2· 4 Å resolution: Subunit interactions and active site / S. Knight, I. Andersson, C. I. Brändén // Journal of molecular biology. – 1990. – Vol. 215, №. 1. – P. 113-160.

26. Kwak, Y. First Azospirillum genome from aquatic environments: Whole-genome sequence of Azospirillum thiophilum BV-S^T, a novel diazotroph harboring a capacity of sulfur-chemolithotrophy from a sulfide spring / Y. Kwak, J. H. Shin // Marine genomics. – 2016.

27. Lindskog S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase / S. Lindskog // Pharmacology and therapeutics. – 1997. – Vol. 74, №. 1. – P. 1-20.

28. Murphy, B. A. Prediction of gene function in methylthioadenosine recycling from regulatory signals / B. A. Murphy, F. J. Grundy, T. M. Henkin // Journal of bacteriology. – 2002. – Vol. 184, № 8. – P. 2314-2318.

29. Occurrence, phylogeny and evolution of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase genes in obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria of the genera Thiomicrospira and Thioalkalimicrobium / T. P. Tourova, E. M. Spiridonova, I. A. Berg [et al.] // Microbiology. – 2006. – Vol. 152, № 7. – P. 2159-2169.

30. Phosphoribulokinase from Chlamydomonas reinhardtii: a Benson–Calvin cycle enzyme enslaved to its cysteine residues / G. Thieulin-Pardo, T. Remy, S. Lignon [et al] // Molecular BioSystems. – 2015. – Vol. 11, № 4. – P. 1134-1145.

31. Presence of a structurally novel type ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase in the hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus kodakaraensis KOD1 / S. Ezaki, N. Maeda, T. Kishimoto [et al.] // Journal of Biological Chemistry. – 1999. – Vol. 274, №. 8. – P. 5078-5082.

32. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Boil. Chem. – 1951. – Vol. 193, №. 1. – P. 265-275.

33. RuBisCO-like proteins as the enolase enzyme in the methionine salvage pathway: functional and evolutionary relationships between RuBisCO-like proteins and photosynthetic RuBisCO / H. Ashida, S. Yohtaro, T. Nakano [et al.] // Journal of experimental botany. – 2008. – Vol. 59, № 7. – P. 1543-1554.

34. Sato, T. Archaeal type III RuBisCOs function in a pathway for AMP metabolism / T. Sato, H. Atomi, T. Imanaka // Science. – 2007. – Vol. 315, № 5814. – P. 1003-1006.

35. Sekowska, A. The methionine salvage pathway in Bacillus subtilis / A. Sekowska, A. Danchin // BMC microbiology. – 2002. – Vol. 2, № 1. – P. 1-14.

36. Smith, K. S. Prokaryotic carbonic anhydrases / K. S. Smith, J. G. Ferry // FEMS microbiology reviews. – 2000. – Vol. 24, №. 4. – P. 335-366.

37. Supuran C. T. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators / C. T. Supuran // Nature reviews Drug discovery. – 2008. – Vol. 7, №. 2. – P. 168-181.

38. Tabita, F. R. Microbial ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a different perspective / F. R. Tabita // Photosynthesis Research. – 1999. – Vol. 60, №. 1. – С. 1-28.

39. The Calvin cycle in cyanobacteria is regulated by CP12 via the NAD (H)/NADP (H) ratio under light/dark conditions / M. Tamoi, T. Miyazaki, T. Fukamizo, S. Shigeoka // The Plant Journal. – 2005. – Vol. 42, № 4. – P. 504-513.

40. The carbon dioxide hydration activity of carbonic anhydrase I. Stop-flow kinetic studies on the native human isoenzymes B and C / R. G. Khalifah // Journal of Biological Chemistry. – 1971. – Vol. 246, №. 8. – P. 2561-2573.

41. The form II fructose 1, 6-bisphosphatase and phosphoribulokinase genes form part of a large operon in Rhodobacter sphaeroides: primary structure and insertional mutagenesis analysis / J. L. Gibson, J. H. Chen, P. A. Tower, F. R. Tabita // Biochemistry. – 1990. – Vol. 29, № 35. – P. 8085-8093.

42. The RAST Server: rapid annotations using subsystems technology / R. K. Aziz, D. Bartels, A. A. Best [et al.] // BMC genomics. – 2008. – Vol. 9, №. 1. – 75 c.

43. Transfer of Conglomeromonas largomobile subsp. largo mobilis to the genus Azospirillum as Azospirillum largo mobile comb. nov. and elevation of Conglomeromonas largomobilis subsp. paroensis to the new type species of Conglomeromonas, Conglomeromonas paroensis sp. nov. / B.Dekhil, M. Cahill, E. Stackebrandt, L. Sly // Syst. Appl. Microbiol. – 1997. – Vol. 20. – P. 72–77.

44. Über das vitamin B 12-bedürfnis phototropher Schwefelbakterien / N. Pfennig, K. D. Lippert // Archives of microbiology. – 1966. – Vol. 55, №. 3. – P. 245-256.

45. Watson, G. M. F. Microbial ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for phylogenetic and enzymological investigation / G. M. F. Watson, F. R. Tabita // FEMS microbiology letters. – 1997. – Vol. 146, №. 1. – С. 13-22.