Призначення та галузі використання амілосубтиліну

Виробництво ферментних препаратів Г10х:

Технічні та очищені ферментні препарати представляють собою або рідини з концентрацією сухих речовин не менше 50 %, або порошки різного кольору з певною стандартною активністю. Іноді препарати містять один фермент, але частіше - комплекс ферментів. Технічні і очищені ферментні препарати мають цілий ряд переваг. Вони містять ферменти в більш концентрованому вигляді, які здатні довше зберігатися без втрат активності. Крім того, очищені ферментні препарати не містять спор мікроорганізмів - продуцентів ферментів [7].

 

Рис. 2.1. Технологічна схема вирощування мікроорганізмів глибинним методом [8]:
1 - змішувач живильного середовища; 2 - стерилізатор; 3 - видержнватель; 4 - редукційний клапан; 5 - теплообмінник; 6 - відцентровий насос; 7 - інокулятор; 8 - індивідуальний повітряний фільтр; 9 - ферментер; 10 - повітряний фільтр; 11 - загальний повітряний фільтр; 12 - повітродувка; 13 - збірник культур

 

Технологічна схема отримання очищених ферментних препаратів при глибинному способі культивування складається представлена на рис.2.2. та складається з наступних стадій: отримання посівного матеріалу, підготовка і стерилізація живильного середовища, стерилізація повітря, засівання живильного середовища, культивування мікроорганізмів - продуцентів в ферментерах, камерах на кюветах або установках, відділення біомаси від культуральної рідини, екстракція ферментів з культури, вирощеної поверхневим способом на твердих поживних середовищах, концентрування культуральної рідини, стандартизація ферментних препаратів, сушка стандартизованих ферментних розчинів в розпилювальних сушарках [9].

Очищені ферментні препарати отримують з водних розчинів ферментів. Для очищення від баластних речовин застосовують ряд методів: діаліз, осадження органічними розчинниками і нейтральними солями, витяг ферментів із складних комплексів методом їх іммобілізації. Ферментні осади, отримані осадженням органічними розчинниками і солями, розчиняють у воді і стандартизують до необхідної активності, а потім сушать в розпилювальних сушарках.

Приготування і стерилізація живильного середовища для глибинного культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів не відрізняються від загальноприйнятих прийомів, застосовуваних у виробництві інших продуктів

мікробного синтезу.

Приготування поживного середовища для вирощування посівного матеріалу і виробничого культивування здійснюється в змішувачах. Посівний матеріал, вирощений в інокуляторах, подається для засіву живильного середовища ферментатора. Для аерування зростаючої культури в інокуляторі і ферментері повітря проходить підготовку і очищення в апаратах: у фільтрі попереднього очищення 10, повітродувці 12, головному фільтрі та індивідуальних фільтрах 8, встановлених у інокулятора і у кожного ферментера. Готова культуральна рідина насосом 6 перекачується в сбірник 13, з якого надходить на виділення ферментного препарату [10].

Отримання посівного матеріалу:

Для виробництва посівного матеріалу використовують вихідний штам продуцентів, одержаний з лабораторних чистих культур. Для приготування необхідної кількості посівного матеріалу на заводі організовується цех чистої культури, який веде постадійне вирощування посівного матеріалу в асептичних умовах, що гарантують розвиток тільки продуцента і повну відсутність інших мікроорганізмів.

Найбільш поширеним способом підтримки вихідної культури продуцента є висівання мікроорганізмів у пробірки на скошені агаризоване середовища з оптимальним для кожного штаму складом і вирощування його до певного віку в оптимальних умовах. Готову культуру в пробірках поміщають в холодильник і

зберігають при температурі 3-4°С [11].

Для тривалого зберігання доцільно використовувати бідні цукрами крохмальні середовища. Більш тривалий час можна зберігати культуру під шаром вазелінового масла. Для цього доцільно використовувати вазелінове масло медичного призначення. Воно не повинно містити токсинів і окислених продуктів. Шар масла повинен бути тільки на 1 см вище агарового зрізу, інакше можлива загибель культури через нестачу кисню Попередньо масло стерилізують при 0,15 МПа протягом 1,5 год. Культуру заливають стерильним маслом після того, як вона

досягне повної фізіологічної зрілості. Для цього способу зберігання найкращим середовищем вважається картопляно - мальтозний агар.

Підготовка посівного матеріалу для глибинного культивування. Для засіву виробничого середовища при глибинному способі культивування посівний матеріал готують також глибинним способом. Вид посівного матеріалу залежить від продуцента: а для бактерій - молода культура.
Етапи отримання посівної культури наступні[12]:

1) обновленя вихідної культури на агаризованому середовищі;

2) вирощування культури на рідкому середовищі в колбах на качалці;

3) культивування продуцента в малому, а потім у великому інокуляторі.

Посівна доза при засіві глибинної культурою велика - від 1 до 15%, тому число стадій і обсяг інокуляторов визначаються продуктивністю підприємства.
Технологічна схема приготування посівного матеріалу для глибинного культивування наведена на рис. 2.1.

Вихідний продуцент з пробірки 1 пересівають на матраци 2 з великим кількістю агаризованого середовища. З матраців культуру змивають стерильною водою і у вигляді суспензії використовують для засіву колб 3. Найчастіше засіви ведуть відразу з пробірки в колби. Колби закріплюють на гойдалці 4, яка струшує рідина в колбах і сприяє розчиненню кисню в середовищі, що забезпечує нормальні умови життєдіяльності мікроорганізмів.Готову культуру з колб збирають в одну ємність при дотриманні правил асептики і переносять в малий інокулятор 5 зі стерильною охолодженою середовищем.

Рис.2.2. Підготовка посівного матеріалу до виробничого біосинтезу [3]

1- пробірки, 2 – матраци, 3 – колби, 4 –гойдалки.

 

Засівши ведуть у полум'ї палаючого факела через посівної патрубок інокулятору. У малий інокулятор через індивідуальний фільтр 6 подається стерильне повітря. Підготовку, стерилізацію та охолодження живильного середовища виробляють в малому інокуляторі. Піногасник стерилізують і охолоджують у спеціальній ємності і подають в малий інокулятор. Для більшого інокулятора 7 середу готують, як правило, в спеціальних апаратах і подають її в стерильний, охолоджений до 60-70°С інокулятор [3]. Готову культуру з малого іно кулятора передавлюють стерильним повітрям у великій інокулятор на свіже живильне середовище.
Культивування на всіх стадіях ведеться при оптимальній температурі і аеруванні. Зазвичай готовий посівний матеріал відразу ж передають у виробництво. Якщо ж виникають непередбачені затримки, то посівний матеріал безпосередньо в інокулятору охолоджують до 8 - 10 °С, але зберігають не більше 3-4 год, оскільки його якість може різко погіршитися. Посівний матеріал, отриманий будь-яким способом, піддається мікробіологічному і біохімічному контролю.
Посівний матеріал вважається активним, якщо він забезпечує нормальну тривалість культивування на виробничому середовищі і досягнення максимального накопичення ферментів за цей термін. Він не повинен містити сторонньої мікрофлори.
Дозування і вік посівного матеріалу: Цей фактор має істотний вплив на хід культивування та біосинтез ферментів. Занижені дози посівного матеріалу призводять до уповільнення процесу культивування. У зв'язку з цим для кожного виробничого штаму встановлюється оптимальне дозування посівного матеріалу[13].

Приготування поживних середовищ: Для приготування поживних середовищ для глибинного культивування основною сировиною служать кукурудзяна мука, крохмаль пшеничний і картопляний, кукурудзяний екстракт, буряковий жом. Джерелом азоту можуть бути мінеральні солі NаNОз, NН₄NО_З, (NН₄)НРО_З, і азот органічних сполук, гідролізати казеїну і дріжджів. Як джерело вуглецю використовують різні вуглеводи, найбільш легко засвоювані мікроорганізмом, - крохмаль, глюкоза, декстрини, мальтоза та ін.

До складу живильного середовища повинні входити такі мінеральні речовини, як фосфор, сірка, залізо, цинк, калій, кальцій, магній та ін.

Етап виробничого біосинтезу:

Отримання кінцевого продукту метаболізму у виробничому ферментаторі становить основну і найтривалішу стадію у всьому технологічному циклівирощування. Одна з основних вимог, яка висувається до ферментеру, - збереження стерильності при інтенсивної аерації живильного середовища під час всього періоду культивування. Ферментер являє собою герметичну циліндричну ємність з сферичними кришкою і днищем. Кращий матеріал для виготовлення ферментатеру - нержавіюча сталь [14]. Ферментер забезпечується теромостатуючими, перемішуючими, аеруючими і регулюючим pH середовища пристроями, обладнаний системою подачі живильного середовища, піногасником.
Виробниче культивування проводять у стерильних умовах. Перед заповненням ферментатора живильним середовищем його миють, перевіряють на герметичність, стерилізують. Одночасно з ферментером парою стерилізують також всю систему трубопроводів. У ферментатор, заповнений стерильною живильним середовищем

(об'єм зазвичай не перевищує 70 % загального обсягу апарату, вводять посівний матеріал. Попередньо температуру і pH поживного середовища доводять до оптимальних значень. Стадія виробничого культивування мікроорганізмів триває 48-72 години. Протягом усього цього періоду зростаючу глибинну культуру забезпечують киснем. Мікроорганізми можуть використовувати тільки розчинений кисень. Насичення киснем живильного середовища здійснюється шляхом аерації, що забезпечує контакт між повітряним і рідкої фазами[11].

Для успішного вирощування виробничих культур велике значення має запобігання піноутворення. Всі ферментери забезпечені пристроями для введення піногасника і контролю висоти піни в апараті. Для зниження утворення можуть використовувати хімічні (рослинні і тваринні масла, різні силікони) і механічні (циклони, встановлюють у верхній частині ферментатора лопаті). Характер піногаснику і періодичність його подачі в ферментер повинні строго контролюватися. Зайве додавання або зайве внесення його на заключній стадії культивування може ускладнити процес виділення кінцевого продукту і звести до мінімуму кількість продукту, яку було отримано під час виробничого культивування.

У процесі культивування ведеться постійний контроль за станом культури і накопиченням продуктів біосинтезу, фіксується споживання основних компонентів середовища (вуглеводи, азот, фосфор), контролюється pH культуральної рідини [12].

Отримання препаратів з індексом П2х і Г2х, ПЗх і ГЗх:

Для отримання технічних ферментних препаратів культуру продуцента звільняють від нерозчинних баластних речовин, тобто залишків твердої живильного середовища. Так як ферменти відносяться до водорозчинних білків, то кращий екстрагент для них - вода.

Для вилучення ендоферментів з бактерій клітинні стінки мікроорганізмів піддають механічному або літичному руйнуванню.
Для отримання технічних препаратів культуральну рідину звільняють від біомаси та концентрують у вакуумі - випарних апаратах при температурі 25-30 °С, що відповідає залишковому тиску в апараті 3-4 кПа. При концентруванні до 50% СВ речовин утворюється нерозчинний неактивний осад. У кількісному відношенні він становить близько 10 % від вмісту СВ. Осад відокремлюють сепарування.

Втрати ферментативної активності в процесі концентрування можуть досягати 10 %. Для стандартизації препарату також використовують хлорид натрію. Отриманий стандартний сироп з індексом Г2х, якщо він є кінцевим продуктом,

розливають в ємності по 40-50 кг [3].

При висушуванні в розпилювальної сушарці дифузійної витяжки та концентрату глибинної культури з вмістом 10-12% СВ отримують препарати з індексом ПЗх і ГЗх. У процесі сушки велика кількість цукрів в дифузійній витяжці і в концентраті глибинної культури приводить до налипання препарату на внутрішню поверхню сушарки. Для запобігання цього до дифузійної витяжці додають хлорид натрію з розрахунку 50 %-ного вмісту СВ, а до концентрату культуральної рідини –

200 кг/м³. Висушений препарат стандартизують по активності хлоридом натрію і фасують в крафт-мішки з поліетиленовими вкладишами[1,13].

Отримання препаратів з індексом П10х і Г10х:

Для отримання очищених ферментних препаратів з індексом Г10х культуральну рідину відділяють від біомаси. Біомаса надходить на сушіння при температурі повітря 300-350°С. Вихід біомаси на 1 м³ культуральної рідини становить 100 кг при вмісті сухих речовин 15 %. Втрата ферменту на цій стадії не перевищують

5 %. Отриманий фільтрат культуральної рідини упарюють до початкового об’єму, в результаті вміст СВ в концентраті збільшується з 2 до 12,5%. При концентруванні розчину ферментів спостерігається випадання неактивного осаду. Втрати
ферментів на цій стадії не перевищують 10 %. Концентрат культуральної рідини звільняють від неактивного осаду на сепараторах. Для осадження амілосубтиліну використовують охолоджений до 4-6 ° С фугат концентрату з вмістом12,5 % СВ. В якості осаджувача ферментів застосовують охолоджений до температури - 4 -10°С етанол. Осадження проводиться при концентрації спирту в суміші 76 % об. при співвідношенні обсягів концентрату культуральної рідини та етанолу 1:4,5. Отримана водно-спиртова суміш подається на сепаратор. Ферментний осад, отриманий після сепарації, розчиняють в трьох об'ємах води, а потім стандартизують бентонітом або желатином, застосовуваними в якості наповнювача. Кількість наповнювача розраховують з урахуванням активності концентрату, готового продукту і втрат у процесі сушіння стандартизованого

ферментного розчину[14].

Отриманий напівпродукт направляють в розпилювальну сушарку. Ферментний осад сушать при температурі теплоносія на вході в сушарку 160°С та на виході з сушарки 60-75°С. Режимом сушіння забезпечують досягнення 8 %-ної вологості матеріалу. На цій стадії втрати амілосубтиліну складають 5-8%.

Висушений і стандартизований препарат фасують по 0,5 кг у поліетиленові мішки, які упаковують в жерстяні коробки. Відокремлений на сепараторі відпрацьований етанол направляють на ректифікацію, де його концентрацію доводять до 96,5 % об. Втрати спирту при ректифікації складають 1%.

Виділення препаратів за допомогою органічних розчинників в ряді випадків дозволяє фракціонувати комплекси ферментів. З таких високочищенних препаратів далі можна отримувати кристалічні ферменти. [15]