Определение общего, свободного и этерифицированного холестерола по реакции Златкиса-Зака

 

На кафедре химии Кировской ГМА способ определения был модифицирован.

В основу определения общего, свободного и этерифицированного холестерола положен кинетический принцип, основанный на разных температурных режимах. При температуре +55-65°С хлорное железо вступает в реакцию и со СХС и ЭХС, в то время как при температуре +20°С хлорное железо в течение первых 2 часов реагирует только с СХС.

Реактивы:

1. Реактив Калиани-Златкиса-Зака. Готовят перед употреблением путем смешивания 3 частей раствора хлорного железа (FeCl₃) в ледяной уксусной кислоте (1 г/л) с 2 частями концентрированной серной кислоты («х.ч.» или «выдерживающей пробу Саваля»). Хранят в бутыли с притертой стеклянной пробкой (для предохранения содержимого от влаги и воздуха).

2. Стандартные растворы холестерола в изопропаноле для построения калибровочного графика.

Ход определения

В пробирки (опытную и контрольную) вносят 2,0 мл реактива Калиани-Златкиса-Зака. К содержимому опытной пробирки добавляют 0,02 мл сыворотки (плазмы) крови. Через 1 ч (60 мин) выдерживания пробы при комнатной температуре (20 °С) содержимое опытной пробирки колориметрируют при длине волны 570 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против контрольной пробы. За указанное время реагирует лишь СХС. Затем пробирки помещают точно на 1 мин (60 сек) в кипящую водяную баню и по извлечении из нее сразу же охлаждают в холодной водопроводной воде (при температуре кипящей водяной бани в сильнокислой среде происходит гидролиз эфиров холестерола и освобождаемый продукт моментально взаимодействует с реактивом с образованием окрашенного соединения). Устанавливают электрический ноль фотометрического прибора по подвергнутой прогреванию контрольной пробе и снова фотометрируют опытную пробу в аналогичных условиях. Из второго результата определения абсорбции, отражающей содержание ОХС, вычитают первый и тем самым находят абсорбцию, приходящуюся на ЭХС. Перевод показателей абсорбции в абсолютные цифры производят по калибровочному графику. Коэффициент этерификации рассчитывают по приведенному выше способу.

 

ТРАНСПОРТНЫЕ ФОРМЫ ЛИПИДОВ

Липопротеины (ЛП) плазмы крови и их классификация

Основными липидами плазмы крови человека являются свободные жирные кислоты (СЖК), ТАГ, фосфолипиды (ФЛ), свободный холестерол (СХС) и его эфиры (ЭХС).

Плазменные липиды в воде не растворимы, поэтому в крови находятся в связанной с белками форме. СЖК связаны с альбумином, а остальные липиды образуют с альфа- и бета-глобулинами так называемые липопротеиновые комплексы (липопротеины).

В процессе функционирования в кровеносном русле ЛП постоянно обмениваются своими составными частями (липидами и белками) между собой и с другими структурами организма, что сопровождается частичным или полным взаимопревращением липопротеинов. На основании этого можно заключить, что липопротеины - это единая функциональная система, осуществляющая транспорт липидов и находящаяся в состоянии динамического равновесия.

Значение главных компонентов ЛП: ТАГ, СХС и ЭХС - это транспортируемые составные части: ФЛ - преимущественно посредники растворения, а белки (апопротеины) являются основными компонентами определяющими специфичность структуры и свойства различных ЛП.

Классификация ЛП

В основу классификации ЛП положены следующие принципы:

I. Деление ЛП на классы по их различиям в плотности и электрофоретической подвижности:

1.) Хиломикроны (ХМ). Электрофоретической подвижностью не обладают и остаются на старте (на месте нанесения исследуемого образца плазмы).

2.) Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), или пре-β-липопротеины. При электрофорезе располагаются перед β-глобулинами.

3.) Липопротеины низкой плотности (ЛПНП), или β-ЛП. При электрофорезе движутся вместе с β-глобулинами.

4.) Липопротеины высокой плотности (ЛПВП), или α-ЛП. При электрофорезе движутся вместе с α-глобулинами.

II. Деление ЛП на основе их апопротеинового компонента:

Приведенные выше классы ЛП определяются как самостоятельные только при ультрацентрифугировании и электрофорезе, тогда как в действительности в плазме содержатся около десятка так называемых первичных ЛП. Каждый из них характеризуется наличием в его составе индивидуального, только ему присущего белка - апопротеина. Эти апопротеины обозначаются латинскими буквами А, В, С, D, Е, Г. Поэтому первичные ЛП также подразделяются на ЛП-А, ЛП-В, ЛП-С и т.д.

Первичные ЛП способны к ассоциации, что приводит к образованию вторичных липопротеиновых комплексов, которые можно обнаружить при ультрацентрифугировании и электрофорезе. Например, ЛПОНП (пре-β-ЛП) содержит ассоциированный комплекс ЛП-В, ЛП-С и ЛП-Е. Образование вторичных комплексов снижается с увеличением их плотности. Так процент ассоциированных комплексов чрезвычайно высок у ХМ и ЛПОНП и очень низок у ЛПВП. Основные физико-химические свойства и краткая характеристика апопротеинов представлены в таблицах.

Как видно из приведенных данных некоторые апопротеины представляют собой семейства апопротеинов. Например, семейство апо-С объединяет апо-С-1, апо-С-2 и апо-С-3. На основании этого также выделяют семейства ЛП: ЛП-А, ЛП-В, ЛП-С и предположительно семейство ЛП-D.

Ниже, в данном пособии, мы рассмотрим отдельные классы ЛП.

 

Таблица 5

Физико-химическая характеристика плазменных липопротеинов

Состав и свойства	ХМ	ЛПОНП (пре-β-ЛП)	ЛПНП (β-ЛП)	ЛПВП (α-ЛП)
Плотность, г/мл	0,95	0,95 - 1,006	1,006 - 1,063	1,063 - 1,210
Размеры, нм	100 - 1200	30 - 90	15 - 25	7 - 10
Молекулярная масса	> 4×10^8	5×10^6- 10×10^6	2,7×10^6- 4,8×10^6	1,7×10^5 - 4,2×10^5
Химический состав (%):
Белок	0,5 - 2,5	6 - 11	20 - 25	45 - 50
ФЛ	2,5 - 10	12 - 18	20 - 25	20 - 30
СХС	0,5 - 1,0	6 - 8	5 - 10	3 - 5
ЭХС	1 - 3	12 - 14	35 - 40	14 - 18
ТАГ	80 - 95	55 - 65	8 - 12	3 - 6
Углеводы	-	-	3 - 5	-
Главные апопротеины	В, С-1	В, С-1	В	А-1, А-2
Минорные апопротеины	С-2, С-3, А-1, А-2	С-2, С-3, А-1, А-2	С, Е, Г	С-1, С-2, С-3, D, Е, Г
Главные липиды	ТАГ-экзогенные	ТАГ-эндогенные	СХС, ЭХС	ФЛ, ЭХС

Таблица 6

Апопротеины плазмы крови

 

Апопротеин	Молекулярная масса	Место синтеза	Биологическая роль
А-1		Стенка кишечника, печень	Активация ЛХАТ
А-2		Стенка кишечника, печень	?
В	точно не определена	Печень, стенка кишечника	Транспорт ТАГ
С-1		Печень	Активация ЛХАТ
С-2		Печень	Активация ЛПЛ
С-3		Печень	Ингибирование ЛПЛ
D		?	Активация ЛХАТ (?)
Е		Печень, стенка кишечника	Транспорт холестерола (?)
Г		?	?

 

Примечание: ЛХАТ - лецитин-холестерол-ацилтрансфераза;

ЛПЛ - липопротеинлипаза.

 

Хиломикроны

Хиломикроны (ХМ) известны с 1774 г., когда английский врач У. Хьюсон обнаружил белесоватый вид крови при кровопускании и установил, что причиной является абсорбционная липемия. В 1920 г. С. Кэйдж локализовал ХМ под микроскопом после приема жирной пищи, как «танцующие в сыворотке частицы, диаметром в несколько раз меньше эритроцитов» и дал им современное название.

ХМ - самые крупные ЛП, главным образом переносят ТАГ из кишечника в печень и жировую ткань. ХМ образуются в энтероцитах, если ТАГ пищи содержат длинноцепочечные жирные кислоты, и когда превалирует всасывание липидов в лимфу. Ключевую роль в сборке частиц играет апопротеин В48. В них также широко представлены апопротеины С-1, С-2, С-3 и имеются апопротеины А-1 и А-2 кишечного и печеночного происхождения. Однако, свежесекретируемые частицы ХМ, практически, лишены апопротеинов С и А и приобретают их в результате контакта с челночными ЛПВП уже в плазме крови. Большое количество ТАГ и малое количество белка обеспечивают малую плотность, вследствие чего при стоянии плазмы крови всплывают и образуют сливкообразный слой. При электрофорезе вследствие большого количества нейтрального жира остаются на старте.

Биологический период полураспада ХМ в крови равен 15 - 20 минут. ТАГ в составе ХМ за несколько минут гидролизуются ЛПЛ в капиллярах жировой ткани и других периферических тканей. Обогащенные холестеролом остатки ХМ, так называемые остаточные частицы, поглощаются печенью. Атерогенностью ХМ не обладают.

В норме в крови ХМ присутствуют в следовых количествах.

Повышение содержания в крови отмечается при гиперлипопротеинемии I и V типа, небольшое повышение при III типе. Вторичная гиперхиломикронемия отмечается при сахарном диабете, панкреатите, избыточной продукции кортикостероидов, гипотиреозе, нефротическом синдроме, анемии, алкоголизме. Хиломикронемия повышает риск тромбоза и эмболии и ведет панкреонекрозу и панкреатитам.

Снижение или отсутствие ХМ наблюдается при абетапротеинемии и гиперлипопротеинемии IV типа.

 

5.3 Липопротеины очень низкой плотности (пре-β-ЛП)

Выделены в 1955 г. Р. Гавелом. При электрофорезе расположены перед фракцией β-глобулинов. Синтезируются главным образом в печени. Это очень изменчивый класс ЛП, включающий достаточно широкий спектр частиц, нагруженных ТАГ в неодинаковой степени. Для продукции ЛПОНП в печени необходим интенсивный синтез фосфолипидов, создающих их гидрофильную оболочку. Чем больше в печень поступает СЖК, тем больше необходимо синтезировать фосфолипидов и создавать частиц ЛПОНП. Печень также синтезирует липиды, подлежащие включению в ЛПОНП из углеводов и, в меньшей степени из аминокислот. При нарушении баланса между поступлением липидов в печень, построением частиц ЛПОНП и их секрецией в кровь возникает ожирение (стеатоз) печени. Все липотропные факторы способствуют образованию фосфолипидов и ЛПОНП. Скорость образования ЛПОНП также зависит от синтеза апопротеинов, поэтому полноценное белковое питание также препятствует ожирению. На синтез ЛПОНП опосредованное влияние оказывают и многие гормоны: инсулин - путем увеличения синтеза жирных кислот, тироксин - через стимуляцию метаболизма холестерола и т. д.

Функции ЛПОНП:

1. Доставляют новосинтезированные в организме ТАГ к жировой ткани.

2. Являются предшественниками следующего класса ЛП - ЛПНП. Те ЛПОНП (примерно 50%) которые не попадают в жировую ткань, под действием ЛПЛ в крови превращаются в ЛПНП.

Образование ТАГ и секреция ЛПОНП печенью усиливается в следующих условиях:

1. При потреблении богатой углеводами пищи (в особенности пищи, содержащей большое количество сахарозы и фруктозы).

2. При высоком содержании свободных жирных кислот в крови.

3. При потреблении алкоголя.

4. При высоких концентрациях инсулина и низких концентрациях глюкогона.

Большой атерогенностью ЛПОНП не обладают, однако, являясь непосредственным предшественником ЛПНП, при определенных условиях могут способствовать развитию атеросклероза.

Плазма при высоком содержании ЛПОНП сливкообразного слоя не образует, однако выглядит мутной.

В клинике, для расчета содержания ЛПОНП в плазме крови используют формулу W. Friedwald:

ХС-ЛПНП = ОХС - ХС-ЛПВП - ХС-ЛПОНП

Для ориентировочной оценки концентрации ХС-ЛПОНП используют величину ТАГ/5, если концентрации холестерола и ТАГ выражены в мг/мл, или ТАГ/2,2, если концентрации холестерола и ТАГ выражены в ммоль/л. Применение этой формулы при концентрации ТАГ выше 400 мг/л приводит к завышению содержания ХС-ЛПОНП и занижению ХС-ЛПНП. Величины ХС-ЛПНП менее 3,4 ммоль/л (130 мг/дл) желательны, поскольку связаны с пониженным риском атеросклероза. Уровень от 3,4 до 4,1 ммоль/л (до 159 мг/дл) считается пограничным, а при превышении 4,2 ммоль/л (160 мг/дл) риск атеросклероза повышен.

Для оценки распределения ЛП у больных с очень высоким уровнем ТАГ и наличием значительного количества ХМ необходимо предварительное ультрацентрифугирование для отделения ХМ и ЛПОНП. После отделения фракции ЛПОНП и преципитации ЛПНП в супернатанте можно определить концентрацию ХС-ЛПВП.

Нормальное содержание в крови составляет 0,8 - 1,5 г/л; у мужчин - 0,67 ± 0,33 г/л, у женщин - 0,45 ± 0,22 г/л.

Повышение концентрации отмечается при гиперлипопротеинемиях III, IV, V типов, гипотиреозе, нефротическом синдроме, уремии, гиперкортицизме, врожденной липодистрофии, алкоголизме, приеме эстрогенов.

5.4 Липопротеины низкой плотности (β-ЛП)

Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) при электорофорезе мигрируют с β-глобулинами. Являются самыми богатыми холестеролом ЛП. Большая часть холестерола в ЛПНП находится в виде эфира линолевой кислоты.

Функция: заключается в переносе холестерола к периферическим тканям и регуляция синтеза холестерола в этих тканях.

Синтезируются в кровотоке из ЛПОНП под действием ЛПЛ, через образование так называемых липопротеинов промежуточной плотности (ЛППП). Уровень ЛППП в плазме крови повышается при нарушении катаболизма ЛПОНП. Этому способствует замедленная потеря из состава ЛП мутантного апопротеина Е (гиперлипопротеинемия III типа). У многих плотоядных видов млекопитающих и у грызунов ЛППП, в основном захватываются гепатоцитами при участии апопротеина В-100 и нацело метаболизируются. Часть ЛППП, не захваченная печенью, при дальнейшем катаболизме с участием как ЛПЛ, так и секретируемой в кровь аналогичной печеночной липазы, образует ЛПНП. У человека, приматов, птиц, свиней и травоядных, в отличие от крыс и некоторых других видов животных, довольно большая часть ЛППП избегает печеночного эндоцитоза. Это приводит к относительно высокому содержанию ХС-ЛПНП у всех этих животных (до 75 % от общего уровня всех форм плазменного холестерола). Данная особенность учитывается при моделировании атеросклероза. Вследствие низкого содержания ЛПНП крысы и плотоядные животные в нормальных условиях атеросклерозу не подвержены. Атеросклеротические изменения у них можно моделировать, подвергая их жесткой стрессовой ситуации (например, жесткая иммобилизация).

Период полувыведения из кровотока апобелка В, входящего в состав ЛПНП, составляет 2,5 суток.

На поверхности фибробластов, лимфоцитов и гладкомышечных клеток артерий человека есть специфические участки связывания или рецепторы для ЛПНП (рецепторы В-100). При семейной гиперхолестеринемии они не функционируют.

Деградация 50 % ЛПНП осуществляется во внепеченочных тканях, а 50 % в - в печени.

ЛПНП являются атерогенными, поскольку существует прямая зависимость между вероятностью возникновения коронарного атеросклероза и концентрацией ЛПНП в крови.

Нормальное содержание в крови ЛПНП составляет 3,2 - 4,5 г/л; у мужчин - 3,03 ± 0,73 г/л, у женщин - 2,82 ± 0,69 г/л.

Повышение концентрации отмечается при гиперлипопротеинемии IIа, IIб, III типов, сахарном диабете, гипотиреозе, атеросклерозе, ксантомантозе, β-плазмоцитоме.

Снижение содержания ЛПНП до 12 - 25 % от нормы может сочетаться со снижением содержания холестерола и ТАГ и сопровождаться очень вариабельной клинической картиной - от тяжелых форм до отсутствия клинических признаков. Резкое снижение или отсутствие ЛПНП - абеталипопротеинемия (синдром Бассен-Корнцвейга) является наследственным заболеванием.

5.5 Липопротеины высокой плотности (α-ЛП)

Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) при электрофорезе мигрируют вместе с α-глобулинами. Синтезируются в печени.

Функции:

1. Обеспечивают удаление избытка СХС из ЛП и из тканей.

2. Перенос холестерола от переферических тканей к печени (обратный транспорт холестерола).

3. Участвуют в метаболизме ХМ и ЛПОНП.

Рядом исследований показано, что ЛПВП выполняют роль «сорбента» продуктов перекисного окисления липидов и обладают ярко выраженными антиоксидантными свойствами. На кафедре химии Кировской ГМА разработан диагностический коэффициент, показывающий роль ЛПВП в поддержании оксидантного баланса в организме, который рассчитывается по формуле:

МДА(ЛПНП+ЛПОНП)×ХС(ЛПНП+ЛПОНП)/МДА (ЛПВП)×ХС (ЛПВП),

где МДА - содержание малонового диальдегида (вторичного продукта перекисного окисления липидов) в мкмоль/л в плазме крови.

По нашим данным величина данного коэффициента у практически здоровых мужчин в возрасте от 18 до 50 лет составляет 3,70 ± 0,54 ед. Установлено снижение коэффициента при регулярной мышечной деятельности, и значительное увеличение при ограничении мышечной активности. Это связано как с содержанием ЛПВП в плазме крови, так и интенсивностью процессов перекисного окисления липидов.

ЛПВП является основным субстратом для лецитин-холестерол-ацетилтрансферазы (ЛХАТ). Этот энзим катализирует перенос жирной кислоты из С-2 положения фосфатидилхолина (лецитина) в на холестерол, в результате чего образуются эфир холестерола и лизофосфатидилхолин (лизолецитин). ЛХАТ, возможно, осуществляет этерификацию СХС и в ЛПНП. Насцентные ЛПВП во время нахождения в кровеносном русле принимают на свою поверхность СХС с мембран периферических клеток или с других ЛП. Затем под действием ЛХАТ и при участии апо-А-2 (активатор ЛХАТ) происходит этерификация части СХС. Образующийся при этом ЭХС перемещается с помощью апо-D и апо-Е с поверхности оболочки внутрь частиц. Формируется ядро, насцентный ЛПВП приобретает нативную сферическую форму и транспортирует холестерол в виде его эфиров в печень. Биологический период полураспада ЛПВП составляет около 4 - 5 дней. Печень является конечным пунктом деградации апобелков ЛПВП.

Увеличение в крови ЛПВП является благоприятным фактором уменьшающим риск развития атеросклероза.

Нормальное содержание в крови ЛПВП составляет 1,3 - 4,2 г/л; у мужчин - 3,38 ± 0,81 г/л, у женщин - 3,84 ± 0,72 г/л.

Повышенное содержание в крови - гиперальфапротеинемия при нормальном или сниженном содержании других фракций липидов клинических проявлений не имеет. Может возникать при приеме эстрогенов.

Снижение уровня ЛПВП специфических клинических проявлений также не имеет, но предрасполагает к развитию ИБС, а также может возникать при циррозе печени, обтурационной желтухе, муковисцидозе, приеме андрогенов. Отсутствие ЛПВП - танжерская болезнь (встречается чрезвычайно редко).

Определения количества b-ЛП в сыворотке крови

Принцип метода: основан на способности b-ЛП осаждаться в присутствии СаСl₂ и гепарина, что сопровождается увеличением мутности раствора. По степени помутнения раствора судят о содержании b- липопротеидов в сыворотке крови.

Ход определения:

1) В кювету фотоэлектроколориметра внести 2 мл 0,27% раствора хлорида кальция и 0,2 мл сыворотки крови;

2) Определить оптическую плотность (Е₁) при красном светофильтре (l-630 нм) против 0,27% раствора хлорида кальция.

3) Раствор из кюветы перелить в пробирку и добавить микропипеткой 0,04 мл 1% раствора гепарина. Содержимое пробирки перемешать и ровно через 4 мин измерить светопоглощение (Е₂) в тех же условиях.

Расчет. Вычисляют разность оптической плотности и по формуле рассчитывают содержание b-липопротеидов в исследуемом образце:

 

Х(г/л)=(Е₂-Е₁)´10

где 10 - эмпиричекий коэффициент.

6. РОЛЬ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА В АДАПТАЦИИ К МЫШЕЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

 

Выполнение физической нагрузки сопровождается значительными изменениями липидного обмена. Биохимические показатели состояния липидного обмена позволяют уже на ранней стадии диагностировать признаки переутомления и вносить коррективы в тренировочный процесс. Адекватная физическая нагрузка способствует снижению содержания холестерола в организме. Такое влияние на обмен холестерола связывается с высвобождением из мышечных систем под влиянием физических упражнений липопротеиновой липазы, обеспечивающей характерные сдвиги метаболизма липопротеинов в плазме крови. Транспорт холестерола в основном осуществляют два класса липопротеинов. Липопротеины низкой плотности (ЛПНП или β-липопротеины), осуществляют транспорт холестерола в периферические органы и ткани, являются атерогенными. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП или α-липопротеины) осуществляющие обратный транспорт холестерола от органов и тканей, обеспечивающие удаление его избытка, являются антиатерогенными. Кроме того, показано, что ЛПВП играют роль «сорбента» продуктов перекисного окисления липидов и обладают ярко выраженными антиоксидантными свойствами. Установлено, что физическое перенапряжение приводит к усилению свободнорадикальных реакций, снижению ресурсов антиоксидантной защиты организма, нарушению обмена холестерола и развитию сердечно-сосудистой патологии. Накопление продуктов свободнорадикальных реакций, также является одним из факторов, существенно ограничивающих физическую работоспособность. Многочисленными исследованиями подтверждено, что регулярная адекватная физическая нагрузка приводит к увеличению содержания в крови ЛПВП. Данное явление особенно характерно при занятии циклическими видами спорта на свежем воздухе (лыжный спорт, конькобежный спорт, езда на велосипеде и т.п.). Увеличение содержания в крови ЛПВП приводит к существенному снижению риска сердечно-сосудистых заболеваний. Отсюда становится очевидным вклад занятий массовым спортом в процесс оздоровления нации. Кроме того, увеличение показателя ЛПВП у спортсменов, особенно циклических видов спорта, способствует повышению у них ресурсов антиоксидантной активности плазмы крови и входит в комплекс механизмов адаптации к характеру двигательной активности. Результаты исследований свидетельствуют о том, что с ростом тренированности существенно возрастает роль ЛПВП в поддержании оксидантного баланса. Это позволяет рекомендовать их в качестве надежного критерия функционального состояния спортсмена.

Кроме того, существует еще один механизм адаптации к физическим нагрузкам. Известно, что запасы холестерина в организме человека распределены неравномерно: в клетках и тканях сконцентрировано 93 % всего его количества, тогда как на долю холестерина циркулирующего в составе липопротеинов приходится 7 %. Поэтому изучение содержания холестерина в клеточных мембранах, в частности в эритроцитах, имеет большое диагностическое значение. В целом, содержание холестерина в эритроцитах в зависимости от характера мышечной деятельности подчинено следующим закономерностям:

1. Снижением его содержания с ростом тренированности.

2. При одинаковой квалификации спортсменов содержание холестерина у представителей циклических видов спорта меньше, чем у ациклических.

Содержание в эритроцитах фосфолипидов носило противоположный характер, что в свою очередь обеспечивает снижение коэффициента холестерин/фосфолипиды с ростом тренированности, особенно у спортсменов циклических видов спорта. Данное явление имеет важное значение в адаптации к мышечной деятельности, поскольку повышает текучесть эритроцитарных мембран и проникновение эритроцитов в капилляры, что улучшает газотранспортные функции эритроцита. Этот механизм особенно важен для спортсменов циклических видов спорта, поскольку в первую очередь повышает устойчивость к длительным аэробным нагрузкам и выносливость.