Современные иммунодиагностические реакции



Мы поможем в написании ваших работ!


Мы поможем в написании ваших работ!



Мы поможем в написании ваших работ!


ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Современные иммунодиагностические реакции



Реакции иммунофлюоресценции (РИФ), иммунолюминесцентный метод (ИЛМ,) метод флуоресцирующих антител (МФА) (англ.Immunofluorescence) - лабораторный иммунологический метод качественного определения антигена по известному глобулину или антител по известному антигену.

Сущность метода флюоресцирующих антител заключается в визуализации реакции антиген-антитело люминесцентными маркерами.

Различают РИФ прямой, РИФ непрямой инепрямой РИФс комплементом.

При прямом методе (пРИФ) на препарат с антигеном наносят известную, предположительно соответствующую ему, люминесцирующую сыворотку. В случае образования комплекса, он обнаруживается, люминесцентной микроскопией в виде зеленоватого свечения разной степени интенсивности и четкости.

При непрямом методе (нРИФ) на мазок из наслоения антигена и немеченой сыворотки наносят антиглобулиновую (видовую по отношению к диагностической сыворотке) люминесцирующую сыворотку. В случае образования комплекса антиген-антитело, последний компонент реагирует с видовой антиглобулиновой люминесцирующей сывороткой. При нРИФ с комплементом, его добавляют к комплексу антиген-антитело и идентифицируют образование тройного комплекса по люминесцирующей антикомплементарной сыворотке.

Результаты описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырех ++++) — субъективная градация исследователем степени выраженности реакции. Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, но требуется множество моноспецифических сывороток. Недостатками всех видов РИФ является ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие глобулины к исследуемым антигенам.

Задание №2. Опираясь на материал, изложенный выше, нарисуйте схему реакции иммунофлюоресценции (прямой и непрямой).

 

Иммуноферментный анализ (ИФА, (англ.enzyme-linkedimmunosorbentassay, ELISA) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

 

Метод ИФА состоит из трех стадий:

 

1. На поверхности лунки планшета, сорбирован белок - антиген инфекционного агента или антитело к нему. В лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови больного. Если в ней содержатся антитела к данному инфекционному агенту или антигены (сами инфекционные агенты), то они образуют иммунные комплексы “антиген-антитело” и остаются связанными при последующей промывке. На этом первая стадия заканчивается. Это основная — “специфическая” стадия процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса.

 

2. На второй стадии анализа в лунку вносят комплекс, состоящий из антитела и фермента (т.н. конъюгат), способный связываться с образовавшимися иммунными комплексами. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то конъюгат с ними связывается.

 

3. На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества — хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом. То есть, если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс. Произошедшая цветовая реакция полностью пропорциональна предшествующей иммунологической, что позволяет выявить и количественно измерить в исследуемом биологическом материале искомый антиген или антитело.

 

Задание №3. Опираясь на материал, изложенный выше, нарисуйте схему постановки иммуноферментного анализа.

 

 

Радиоиммунологический анализ (РИА), радио-иммунный метод (РИМ).

Радиоиммунологический анализ - метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют invitro. Для РИА выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

Задание №4. Опираясь на материал, изложенный выше, нарисуйте схему постановки радиоиммунного анализа.

 

 

Иммуноблоттинг (вестернблоттинг) - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

 

 

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг - от англ, blot, пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с "блотами" антигенов*. На эти полоски наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента.

 

 

Занятие № 10                                                                          Дата_____________________

Тема: Иммунный статус.

Основные вопросы, разбираемые на занятии :

1. Что такое иммунный статус.

2. Что такое иммунная диагностика.

3. Основные показания, характеристики и отличия тестов 1-го и 2-го уровней.

4. Биологические материалы, используемые для иммунодиагностики.

5. Патогенетический принцип оценки функций иммунной системы.

6. Определение термина иммунорегуляторный индекс.

7. Современные методы иммуноанализа.

8. Клиническое значение изменения содержания в крови основных субпопуляций лимфоцитов.

9. Современные подходы к определению функции фагоцитоза

10. Клиническое значение изменения содержания в крови компонентов комплемента.

Иммунный статус - комплекс количественных и функциональных показателей, отражающих конкретное состояние иммунной системы, определяемое с помощью стандартных общепринятых тестов.

Кроме того, выделяют понятие «иммунодиагностика».

Иммунодиагностика - проведение лабораторного и клинического исследований, которые помогают выявить конкретные нарушения в иммунной системе, позволяющие:

1) выявить нарушенное звено в стройной системе функционирования иммунной системы;

2) провести анализ этиологии, патогенеза, прогноза заболевания;

3) выбрать средство иммунокоррекции;

4) провести оценку эффективности проводимой иммунокоррегирующей терапии.

 



Последнее изменение этой страницы: 2021-04-05; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.229.142.104 (0.007 с.)