Методы ДНК-диагностики. Использование ПЦР в медицинской диагностике.

ДНК-диагностика совокупность методов по выявлению изменений в структуре генома с целью диагностики наследственных заболеваний

ДНК-диагностика изучает непосредственную причину заболевания. Наиболее адекватная и тонкая диагностика. Возможна в тех случаях, когда неизвестен ген, ответственный за заболевание.

Виды ДНК диагностики: подтверждающая, пресимптоматическая, диагностика носительства и пренатальная.

ПОДТВЕРЖДАЮЩАЯ: биохимическая картина не ясна, никакая биохимия не позволяет выяснить гетерозиготное носительство. ’Врач сомневается в диагнозе. Эта диагностика ничего не может исключить, а только подтвердить.

ПРЕСИМПТОМАТИЧЕСКАЯ: заболевания Хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера. Данные анализа отдаются только врачу, так как возможен суицид. Хорея Гентингтона - болезнь экспансии. Пренатальная диагностика с 1992 г. позволила уменьшить число суицидов.

ДИАГНОСТИКА НОСИТЕЛЬСТВА, сцепленного с Х–хромосомой (гемофилия, миодистрофия Дюшенна). Если женщина – носитель, то все мальчики будут больны, а девочки здоровы.

ПРЕНАТАЛЬНАЯ: прогноз потомства, т.к для большинства наследственных болезней лечения не существует. Материал – ворсинки Хориона, хориоцентез на 9-12 неделе беременности. Если хориоцентез не успели, то берется кордоцентез (до 22 недель, после 22 недели нельзя).

Типы ДНК-диагностики:

· Прямая - Определение мутации в гене, являющейся непосредственной причиной заболевания;

·  Косвенная - Определение хромосомы, несущей поврежденный ген при семейном анализе

ПРЯМАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА:

+ 100%-ная точность; возможна при сомнительном диагнозе; возможна при полилокусных заболеваниях; возможна беспробандная диагностика;

- необходимо знание структуры гена; информативна не для всех семей.

Прямая ДНК-диагностика предполагает непосредственное выявление мутации в исследуемом гене. Методические подходы, используемые при прямой ДНК-диагностике того или иного наследственного заболевания, зависят от характера мутаций и молекулярной организации соответствующего гена. Методы прямой ДНК-диагностики: Количественная флюоресцентная ПЦР; Real-time ПЦР; Анализ кривой плавления; MLPA-анализ (количественная лигазная реакция); Ресеквенирование.

Из методов прямой ДНК-диагностики чаще всего используется количественная флюоресцентная ПЦР...

В настоящее время большинство протоколов прямой ДНК-диагностики базируется на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Изящность, простота исполнения, непревзойденные показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность. За короткое время ПЦР-анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий научных институтов в сферу практического клинического использования.

Разработка принципов ПЦР стала поистине революционизирующим этапом в развитии молекулярной генетики, что нашло свое отражение в присуждении ее автору Кэри Муллису Нобелевской премии за 1993 год в области химии. Этот метод находится в постоянном развитии, с появлением все новых и новых модификаций, существенно расширяющих его диагностические и исследовательские возможности.

Диагностика наследственных заболеваний, инфекционных заболеваний, в том числе: вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию, генотипирование микроорганизмов, оценка их вирулентности, определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, генодиагностика и генетическая дактилоскопия, пренатальная диагностика, биологический контроль препаратов крови - вот далеко не полный перечень направлений медицины, где с успехом применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Принцип действия ПЦР заключается в амплификации (лат. amplificatio — усиление, увеличение), последовательностей ДНК совершенно невероятным способом.

Основы ПЦР Мы начинаем с фрагмента ДНК, который хотим амплифицировать для получения множества копий. Что нам для этого нужно?

 1) Нам нужно несколько молекул ДНК, включающих фрагмент ДНК, который мы хотим амплифицировать. Назовем такую молекулу «матрица», а интересующий нас фрагмент назовем «заданная последовательность». Двунитевая ДНК Матрица ДНК для ПЦР Заданная последовательность

 2) Нам потребуется два праймера ПЦР. Праймеры представляют собой короткие фрагменты однонитевой ДНК, совпадающие с последовательностями обоих концов нашего заданного фрагмента ДНК. Они нужны для запуска синтеза ДНК.

Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для "+"-цепи, второй для "-"-цепи. Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.

3) Фермент для производства копий ДНК. Мы используем Tag полимеразу из Thermus aguaticus (грамотрицательная палочковидная экстремально-термофильная бактерия обитает в гейзерах). Термостабильные ферменты (в особенности термостабильная Taq-полимераза) используются как инструменты в молекулярно- генетических исследованиях.

Дальнейший анализ продуктов ПЦР в процессе прямой ДНК-диагностики предполагает исследование конкретных особенностей амплифицированного участка гена (дополнительной копии гена). Для быстрой диагностики носительства делеций в гене дистрофина у больных прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшенна и Бекера проводится одновременная амплификация набора наиболее часто мутирующих экзонов данного гена. Поскольку эти заболевания наследуются по X- сцепленному рецессивному типу и связаны с повреждением у мальчиков единственной X- хромосомы, в случае протяженной делеции при электрофорезе продуктов реакции будет выявлено отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК (экзонов), что может служить молекулярным подтверждением диагноза. Таким же сравнительно простым путем с помощью анализа размеров продуктов ПЦР на электрофореграмме может проводиться прямая детекция делеций и вставок в составе амплифицированного участка гена. Протяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть выявлены по изменению длины. При отсутствии делеций амплифицированные фрагменты после электрофоретического разделения и окрашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Выбирая определенные участки гена для амплификации, можно оценить размер делеции с точностью до экзона и определить её локализацию внутри гена.

Более сложную задачу представляет собой выявление точковых мутаций (чаще всего нуклеотидных замен) в определенных сайтах. Для этой цели метод ПЦР используется в комбинации с другими методами молекулярно-генетического анализа.

Существует большое число модификаций метода ПЦР, разработанных для быстрого сканирования и поиска известных генных мутаций. Среди них более подробного упоминания заслуживают следующие подходы:    

  Метод сайт-направленной модификации амплифицированной ДНК — основан на использовании в ПЦР так называемого mismatch (мисматч)-nраймера (не полностью комплементарного матрице), который отличается от матричной ДНК-последовательности на один нуклеотид и взаимодействует с мутантным нуклеотидом. В дальнейшем проводят электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов ДНК. ПЦР нормального и мутантного аллеля отличаются друг от друга..

Метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR) — используется в тех случаях, когда в качестве объекта исследования удобнее использовать не геномную ДНК, а более компактную и информационно “насыщенную” кДНК, получаемую после соответствующей обработки образцов тканей, например, биопсийного материала или клеточных линий лимфоцитов, фибробластов и т.д. Важным условием здесь является экспрессия (хотя бы в минимальной степени) нужного гена в исследуемой ткани. кДНК (комплементарная) – одноцепочная молекула, полученная путем обратной транскрипции на мРНК и содержащая только экзоны (кодирующие участки гена).

На первом этапе проводится обратная транскрипция мРНК, и получаемые молекулы кДНК служат матрицей для полимеразной цепной реакции. Последний метод особенно эффективен для детекции мутаций, ведущих к синтезу “усеченного” белка (нонсенс-мутации, мутации сплайсинга, крупные делеции) — так называемый РТТ-анализ (Protein Truncation Test).

Косвенная ДНК-диагностика и анализ генетического сцепления

Принцип косвенной ДНК-диагностики

Если непосредственное определение мутаций в анализируемом гене невозможно или затруднено, для определения генетического статуса консультируемых лиц в семье, отягощенной наследственным заболеванием, может быть использована косвенная (непрямая) ДНК-диагностика. Она возможна в том случае, если ген заболевания достаточно точно картирован, т.е. локализован в конкретном и достаточно узком участке определенной хромосомы.

Важно подчеркнуть, что косвенная ДНК-диагностика может проводиться даже в тех случаях, когда какая-либо другая информация о гене болезни, помимо его хромосомного расположения, отсутствует (т.е. когда неизвестны структура и размер гена, характер мутаций в нем, кодируемый геном белок и т.д.).

Сущность косвенной ДНК- диагностики заключается в анализе наследования у больных и здоровых членов семьи полиморфных (гипервариабельных) генетических маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области и, следовательно, сцепленных с геном болезни.

В качестве полиморфных маркеров выступают участки ДНК, существующие в виде нескольких возможных аллельных вариантов и различающиеся у разных лиц по тем или иным структурным особенностям (например, по нуклеотидным заменам в определенном сайте или по числу копий ди- и тетрануклеотидных повторов).

Термин “сцепление” (один из ключевых терминов клинической и молекулярной генетики) означает, что анализируемый маркер располагается в непосредственной близости от патологического гена, в связи с чем маркер и ген болезни после кроссинговера остаются в составе одного хромосомного сегмента и передаются потомству как единое целое. Благодаря вариабельности состава таких маркерных участков ДНК обычно удается дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного маркерного аллеля при анализе ДНК обследуемого лица (т.е. определить фазу сцепления). Анализ полиморфных генетических маркеров имеет целью проследить в ряду поколений наследование каждой из родительских хромосом.

На практике для повышения точности и информативности косвенной ДНК-диагностики обычно используют несколько маркеров, расположенных в изучаемой хромосомной области. Идеальным является использование внутригенных маркеров в комбинации с тесно сцепленными маркерами, фланкирующими изучаемый ген с теломерной и центромерной сторон.

Таким образом, для каждого из хромосомных локусов можно установить и графически реконструировать последовательную серию аллелей изучаемых генетических маркеров. Такая комбинация аллелей различных локусов на одной хромосоме носит название гаплотип.

При невозможности обнаружения конкретных нуклеотидных изменений в гене проводится косвенная ДНК-диагностика с вне- или внутригенными маркерами, позволяющая оценивать сегрегацию патологического участка Х-хромосомы у матери, больного ребенка и плода и тем самым с высокой вероятностью определять генетический статус плода.

 Косвенная ДНК-диагностика некоторых заболеваний, для которых прямая очень дорога и/или трудоемка

Косвенная ДНК-диагностика обладает тремя основными недостатками:

 1) Для ее проведения требуется анализ ДНК нескольких членов семьи, как правило, из двух-трех поколений; таким образом, в неполных (неинформативных) семьях такая диагностика невозможна.

2) Для проведения косвенной ДНК- диагностики у лиц из группы риска необходимо предварительно диагностировать заболевание хотя бы у одного индивида в родословной; следовательно, косвенный подход неприменим для ДНК-диагностики единичных (спорадических) случаев заболевания.

3) При проведении косвенной ДНК- диагностики всегда существует вероятность ошибки, связанная с возможной рекомбинацией в мейозе между геном болезни и исследуемым маркером, в результате чего “патологический” маркерный аллель и ген болезни у потомка разойдутся по разным хромосомам.

63. Методы молекулярной биологии: гель-электрофорез, флюоресцентный метод, полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Методы флюоресцентной гибридизации in situ (FISH -диагностика).

Методы прямой ДНК-диагностики:

· Количественная флюоресцентная ПЦР;

· Real-time ПЦР;

· Анализ кривой плавления;

· MLPA-анализ (количественная лигазная реакция);

· Ресеквенирование.

Из методов прямой ДНК-диагностики чаще всего используется количественная флюоресцентная ПЦР... MLPA-анализ (количественный анализ копий). Ошибка - 16%. Real-time ПЦР для определения моногенных заболеваний нам не нужна, так как точность меньше чем в MLPA, и ошибка составляет 25%.

 ПДФР базируется на методе гель-электрофореза.

Электрофорез ДНК в агарозном геле — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине). Плазмидная ДНК образует вторичные структуры, например, скручивается, в суперспираль. Таким образом, чтобы определить размер плазмиды, необходимо разрушить элементы вторичной структуры. Для этого перед нанесением на гель плазмиду «линеризуют», то есть обрабатывают одной из рестриктаз (эндонуклеаз). Рестриктазу выбирают так, чтобы она разрезала плазмиду только в одном месте.

Для разделения фрагментов ДНК разной длины используют гель с различной концентрацией агарозы. Чем меньше длина разделяемых фрагментов ДНК, тем больше должна быть концентрация агарозы.

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в гене РАН (12q24.1) – ФКУ.

Изменчивость нуклеотидной последовательности ДНК, которую обнаруживают с помощью переваривания ДНК ферментами рестрикции по образованию фрагментов разной длины, выявляемых с помощью электрофореза и переноса на плотную среду с гибридизацией меченой пробой.

FISH-метод: локус-специфическая флюоресцентная гибридизация in situ

· Пренатальная или предимплантационная диагностика наиболее частых анеуплоидий (интерфазная FISH – локус-специфическая флюоресцентная гибридизация);

· Диагностика известных микроделеционных синдромов;

· Уточнение цитогенетического диагноза;

· Идентификация сверхчисленных маркерных хромосом;

· Диагностика сложных комплексных хромосомных аберраций

Гибридизация нуклеиновых кислот in situ была разработана для локализации фрагментов нуклеиновых кислот в метафазных и профазных хромосомах. Это нашло широкое применение в анализе хромосомных патологий. В его основе лежит создание препаратов ДНК, содержащих последовательности нуклеотидов, отвечающих определенным требованиям. Гибридизация in situ заключается в денатурации ДНК-пробы и цитологического препарата с последующей ренатурацией, обеспечивающей формирование дуплексов меченной ДНК и ДНК-препарата.

МЕТАФАЗНАЯ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕНОМНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ (CGH) array-CGH (СГГ – сравнительная геномная гибридизация)

· Возможность одновременной детекции ануплоидий, делеций, дупликаций и/или амплификации любого локуса, представленного на микрочипе

1 анализ array CGH эквивалентен 1000 FISH-анализам!

· Мощный инструмент детекции субмикроскопических хромосомных аномалий у пациентов с идиопатической умственной отсталостью и множественными врожденными пороками развития 

· Обеспечивает более детальный, автоматизированный и менее субъективный анализ аномального количества копий ДНК по сравнению со стандартным цитогенетическим исследованием 

· Может быть использован при исследовании архивного материала и тканей с неделящимися клетками

Сравнительная геномная гибридизация – новый стандарт диагностики в репродуктивной медицине. Сравнительная геномная гибридизация имеет разрешение в 1000 и более раз выше, чем обычное кариотипирование. CGH Array является единственным методом, позволяющим диагностировать все возможные микроделецийные синдромы в пределах всего генома, что позволит своевременно провести соответствующую коррекцию ВПР и поспособствует тем самым снижению смертности, инвалидности детей и повышению уровня их здоровья.

Мутационный скрининг гена

Для обнаружения неизвестных нуклеотидных замен в анализируемом участке (участках) гена возникает необходимость проведения секвенирования - определения точной нуклеотидной последовательности определенного фрагмента ДНК. На практике наиболее широкое распространение получило секвенирование по классическому методу Сэнгера.

• Особенностью скрининговых технологий является то обстоятельство, что после предварительного отбора аномальных образцов наличие мутации подтверждается секвенированием.

 • В конкретных популяциях мутационный поиск при том или ином наследственном заболевании может быть существенно упрощен в связи с высокой частотой так называемых мажорных мутаций, т.е. мутаций, которые являются преобладающими и обусловливают значительный процент всех случаев заболевания в данной популяции.