Получение феофитинов из спирулины

 

г сухой измельченной спирулины экстрагировали в 1 дм³ этанола. Хорошо перемешивали и ставили в тёмное место. Полученный экстракт упаривали примерно до 50мл. Затем подкисляли соляной кислотой (9 Н₂О:1 НСl). Спирт после ротора заново заливали для дальнейшего экстрагирования. Через несколько дней выпавшие феофетины отфильтровывали. Отмывали небольшим количеством воды для нейтрализации кислоты (проверяли с помощью индикаторной бумажки), затем спиртом до обесцвечивания раствора. Феофитины на фильтре оставляли сушиться на воздухе. (Раствор после промывания выливать не следует, оставляли для дальнейшего выпадения феофитинов). Экстрагирование проводили 4 раза. Получали 0,7 г феофитинов.

Получение метилфеофорбида(а) из феофитинов

 

Высушенные 0,7 г феофитинов растворяли в смеси 34 см³ метанола и 1,4 см³ концентрированной серной кислоты. Смесь кипятили в течение 60 минут с обратным холодильником. Далее в остывшую реакционную смесь прилили 70 см³ дистиллированной воды. Выпавший в осадок метилфеофорбид (а) отфильтровали и отмыли водой до рН промывных вод (от метанола и серной кислоты). Растворили метилфеофорбид (а) на фильтрах в 50 см³ хлороформе высушили над безводным сульфатом натрия. Раствор упаривали досуха на роторе. Полученную смесь метилфеофорбидов разделяли колоночной хроматографией на силикагеле с изменением соотношения компонентов элюирующей системы (ССI₄ : ацетон) от 80:1 до 50:1. За ходом разделения следили при помощи TCX (Silufol, СС1₄: ацетон - 4:1). Фракцию, содержащую основное вещество, упарили и получили метилфеофорбид (а).

Хроматографическое исследование соединений

Метод ТСХ. Контроль за процессами выделения, разделения и превращениями производных хлорофилла при помощи ТСХ проводили на пластинках Silufol и Sorbifol. В качестве элюентов использовали смеси ССI₄ с ацетоном в соотношениях 4:1 (по обьему).

Для сравнения хроматографической подвижности в условиях тонкослойной хроматографии использовали метод свидетеля. Для этого исследуемая смесь и эталонный образец хроматографировали на одной и той же пластинке, совпадения значений R_f при близких концентрациях исследуемого пигмента и “свидетеля” означает хроматографическую идентичность этих соединений в данной хроматографической системе.

 

Обсуждение результатов

3.1 Получение метилфеофорбида (а)

 

Получение метилфеофорбида а из спирулины через феофитины см. Рисунок 15.

 

Рисунок 15. Схема получения метилфеофорбида а

 

Для получения метилфеофорбида а сухую спирулину экстрагировали настаиванием с этанолом и полученный этанольный экстракт подкисляли разбавленной соляной кислотой (7%). Феофитины в отличие от хлорофиллов плохо растворимы в этаноле. Поэтому, когда при подкислении густого этанольного экстракта спирулины соляной кислотой, происходит удаление магния из координационной сферы хлорофиллов, образующиеся феофитины выпадают в осадок. Считается, что, поскольку кислота добавляется в относительно небольшом количестве, другие вещества осаждаются с феофитинами незначительно. Далее экстракт подкисляли соляной кислотой и выпавшие при этом в осадок феофитины обрабатывали метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты. Превращения хлорофиллов, происходящие при этом, можно представить следующим образом (см. 16)

 

Рисунок 16 Получение метилфеофорбида а из хлорофиллов (где С₂₀H₃₉ - фрагмент спирта фитола, этерифицирующего фитилпропионатный заместитель хлорофиллов высших растений).

 

Колоночной хроматографией и кристаллизацией был выделен метилфеофорбид а массой 70 мг. Строение полученного соединения подтверждено данными ПМР- и ИК-спектроскопии (приложение А, приложение Б).

 

Выводы

1. Проведен анализ литературы по реакциям восстановления метилфеофорбида а.

2. Отработана методика выделения производных хлорофилла а из спирулины.

3. Методом колоночной хроматографии выделен метилфеофорбид а. Структура полученного соединения подтверждена методом ИК- и ЯМР-спектроскопии.

Список использованной литературы

 

1 Kenner G. V., Mac Combie S. W., Smith K. M. Pyrrols end related compounds. Part XXIV. Separation and oxidative degradation of chlorophyll derivatives. // J. Chem. Soc. Percin Trans 1 (1973) p. 2517-2523.

Smith K. M., Bushell M.J., Rimmer J, Unsworth J.F. Bacteriochlorophylls (c) from Chloropseudomonas etilenium. Comparation and NMR studies of the pheophorbides and derivatives.// J. Chem. Soc. (1980) v 102, p. 2437-2448

Seely G. R. The structure and chemistry of functional groups. In “The chlorophylls” //ed. By L. P. Seely and C.R. Vernon,N-Y., Acad. Press (1966) p. 67-108

Миронов А. Ф. Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлорофиллов. // Росс. Хим. Журн. (1998) №5, с. 23-26

Mironov A. N., Efremov A. V., Efremova O. A., Bonnet R. Novel chlorines with δ-lacton ring.// Mendeleev Commun. (1997) p. 244-245

6 Abraham R.J., Rowan A.E., Smith N.N., Smith K. M. NMR spectra of the porphyrins. Part 42. The synthesis and aggregation behavior of some chlorophylls analogous. // J. Chem. Soc. Perkin Trans 2 (1993) p. 1047-1059

Osuka A., Wada U., Shinoda S. Covalently linked pyropheophorbide dimmers as model of thr special pair in the photosynthetic reaction center. // Tetragedron (19960 v. 52., № 12, p. 4311-4326

Fuscher R., Engel N., Henseleler A., Gossauer A. Synthesis of chlorophyll (a) labeled at C(3²) from pheophorbide (a) methyl ester. // Helv. Chem. Acta (1994) v. 77, p. 1046-1050

Smith K. M., Bisset J. M.F., Bushell M.J. partial synthesis of optically pure methyl bacteriopheophorbides (c) and (D) from methyl pheophorbides (a). // J. Org. Chem.(19800 v. 45, p. 2218-2224

Tamiaki H., Miyatake T., Tanicaga R. Self-aggregation of synthetic zinc chlorines possessing “invers” keto-hydroxyl groups.// Tetragedron Lett. (1997) voll. 38, № 2, p. 267-270.

Mettath S., Shibata M., Alderfer J. L., Seng M.O., Smith K. M., Rein R., Dougherty T.J., Pandey R.K. Synthesis and spectroscopic properties of novel benzochlorines derived from chlorophyll (a).// J. Org. Chem. (1998) v. 63, p. 1646-1656.

    Бажанова, Н.В., Маслова, Т.Г., Попова, И.А., Попова, О.Ф., Сапожников, Д.И., Эйдельман, З.М. При участии Черноморского, С.М. и Меницкой, Я.М. Пигменты пластид зеленых растений и методика их исследования. - М.-Л.: Наука, 1964. - 120 с.

     Порфирины: структура, свойства, синтез. / Под ред. Н.С. Ениколопяна - М.: Наука, 1985. - 334 с.

Wasielewski M.R., Johnson D.J., Neimczuc M.P., Gaines G.l., O’Neil M.P., Svec W.A. Chlorophyll-porphyrin heterodimers with orthogonal π-systems: solvents polarity dependent photophysics.// J.Am. Chem. Soc. (1990) v. 112, p. 6482-6488.

Tamiaki H., Kouba M. Synthesis of chlorophyll (a) homologos by Wittig and Knoevenagel reaction with methyl pyropheophorbide (d).// Tetragedron (1997) v. 53, №31, p. 10677-10688.

Ломова Т. Н. Основы синтеза и механизмы химических превращений порфиринов и их аналогов. Часть 1,2 Текст лекций. Иваново 2007, с.78.

Smith K. M., Goff D.A., Simpson D. J. Mesosubstitution of chlorophyll derivatives: direct rote for transformation of bacteriopheophorbides (d) into bacteriopheophorbides (c).// J. Am. Chem. Soc. (1985) v. 107, p. 7946-4954

 

 

Приложение А

 

Положение и мультиплетность сигналов спектров ПМР метилфеофорбида а

 

Отнесение сигналов	Метилфеофорбид а (литературные данные)
10-Н	9,48 (с 1Н)
5-Н	9,33 (с 1Н)
20-Н	8,58 (с 1Н)
3(1)-Н	7,97 (д д, 1Н, 18,4 и 11,5 Гц)
3(2)-Н (транс)	6,27 (дд 1Н, 17,8 и 1,4 Гц)
3(2)-Н (цис)	6,17 (дд 1Н, 12,8 и 1,4 Гц)
13(2)-СН2	6,28 (с 2Н)
18-Н	4,48 (м 1Н)
17-Н	4,22 (м 1Н)
13(4)- СН3	3,91 (с 3Н)
12(1)-СН3	3,65 (с 3Н)
17(4)-СН3	3,59 (с 3Н)
2(1)-СН3	3,40 (с 3Н)
7(1)-СН3	3,19 (с 3Н)
8(1)-СН2	3,61 (кв 2Н, 8,1 Гц)
17(1),17(2)-СН2	2,39-2,20 (м 4Н)
18(1)-СН3	1,84 (д 3Н, 7,2 Гц)
8(2)-СН3	1,68 (т 3H, 7,6 Гц)
I-NH	-
III-NH	-

 

 

Приложение Б

 

Положение полос в ИК-спектре (ν, см-1) метилфеофорбида а

Отнесение	Метилфеофорбид а
ν С=N (оксима)	-
Колебания хлоринового цикла
«хлориновая полоса»	1624
скелетные колебания хлоринового цикла	1558 1504 1352 1300 776
Колебания винильной группы
νпл (-СН2 -)	1404
νвнепл (-СН2 -)	990,916
ν C=С	900
Колебания алифатических заместителей
ν (-CH3)	2964
ν (-CH2-)	2936
νножн (-CH2-)	1455
νas (-CH3)	1438
Колебания кето-группы в экзоцикле
ν C=О	1706
Колебания кето-группы в экзоцикле
ν С=О	1476
νasС=О	1224
νsС=О	1036
νs(СH3 в СООС H3)	1372
Колебания карбоксильной группы
ν С=О	-
	-
ν ОH (уш. полоса)	-
NH полоса в хлориновом цикле	3412