Принцип диагностики ГЭ крс с помощью иммуноблотинга

Патологическая изоформа прионного белка (PrP^Sc) в отличие от всех остальных белков мозга устойчива к протеиназе К. Это свойство используется для его выделения: после обработки протеиназой К в пробе остаётся только PrP^Sc, если проба положительная, либо не остаётся никаких белков, если проба отрицательная.

Для определения молекулярной массы белков пробы после обработки протеиназой К проводят их электрофорез в агаровом или полиакриламидном геле. Скорость перемещения белков в геле при электрофорезе зависит от их заряда и молекулярной массы. С целью упрощения иммунодетекции разделённые в электрофорезе белки переносят из гелей на мембрану при помощи процедуры блотинга. Принцип её заключается в том, что белки извлекаются из геля под действием электрического поля и сразу же адсорбируются на мембране.

Для определения иммунологических свойств перенесенных на мембрану белков проводят обработку мембраны антителами, специфичными к PrP^Sc, затем промывают антивидовыми антителами, мечеными ферментом. При нанесении на мембрану субстратной смеси она разлагается ферментом с образованием окрашенного или люминесцирующего продукта реакции, в зависимости от вида применяемых ферментов и субстратных смесей. Если на мембране присутствует PrP^Sc, происходит связывание с ним вначале первых, а затем вторых антител. При разложении ферментом, коньюгированным со вторым антителом субстратной смеси, окрашенный, либо люминесцирующий продукт реакции образуется в месте расположения прионного белка.

Таким образом, PrP^Sc выявляется в иммуноблотинге с учётом трёх характеристик: устойчивости к протеиназе К, определённого размера молекул при электрофорезе (27-30 kDa) и связывания со специфическим антителом.

Техника постановки иммуноблотинга состоит из следующих этапов:

Ø отбор проб;

Ø гомогенизация пробы;

Ø ферментное разрушение пробы;

Ø электрофорез;

Ø блотинг;

Ø обработка антителами;

Ø проявление реакции;

Ø учёт реакции;

Ø интерпретация результатов.

Техника постановки иммуноблотинга

 

Отбор, гомогенизация и ферментное разрушение пробы.

Отбор проб. Для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота используется продолговатый мозг животных. Отбор проб производится через отверстие затылочной кости с помощью специальной ложечки.

Гомогенизация. Кусочек продолговатого мозга из области задвижки массой 0,45-0,7 г помещают в 50 мл пробирку и с помощью весов определяют точный вес пробы. К кусочку мозга добавляют 10-кратный объём буфера для гомогенизации. Затем проба гомогенизируется в течение 1 мин при помощи гомогенизатора при 20000 об/мин.

Ферментное разрушение. В связи с тем, что прион PrP^Sc устойчив к протеиназе К, важным моментом является его ферментация. Для этого в 96-луночный планшет с объемом лунки 0,2 мл для ферментного разрушения вносят по 100 мкл каждого гомогената, добавляют 10 мкл протеиназы К (20 ЕД/мл) и хорошо перемешивают пипетированием. Ферментное разрушение проводят при 48°С в течение 40 мин. После инкубации добавляют 10 мкл останавливающего раствора для остановки протеолитической реакции.

Электрофорез.

Принцип электрофореза белков в геле основан на явлении пространственного разделения белков при их движении в электрическом поле. Белки, как биополимеры, обладающие зарядом, перемещаются в электрическом поле в направлении противоположно заряженного полюса. При этом скорость миграции белков в геле зависит от их заряда и молекулярной массы. Поскольку эти характеристики различны у разных белков, методом электрофореза можно добиться разделения сложной белковой смеси на отдельные белки.

Денатурация. Денатурация белков приводит к нарушению вторичной и третичной структур белка, “разворачиванию" молекулы. При этом заряд белка, его линейные размеры и, следовательно, скорость миграции белков в геле становятся прямо пропорциональны их молекулярной массе, что даёт возможность точно её определить, сравнивая электрофоретическую подвижность исследуемого белка с электрофоретической подвижностью белков с известной молекулярной массой. Для этого к разрушенным протеиназой К пробам добавляют PAGE-буфер по 100 мкл на лунку с целью подготовки проб для электрофореза, хорошо перемешивают пипетированием и инкубируют при 96°С в течение 5 мин. Контрольный образец инкубируют при 65°С в течение 2 мин. Старые пробы, которые уже были проинкубированы при 96°С в течение 5 мин, также инкубируют при 65°С в течение 2 мин.

Состав буфера для подготовки проб для электрофореза (40 мл):

Нанесение исследуемых проб на гель. 10 мкл контрольного образца наносят на первую дорожку геля. На остальные дорожки наносят по 10 мкл исследуемых проб. Внутреннюю и наружную камеры электрофоретической камеры заполняют буфером для электрофореза NuPAGE MOPS/SDS и добавляют 500 мкл антиоксиданта (NOVEX) только во внутреннюю камеру (рис.7).

Состав буфера для электрофореза:

Электрофорез. Электрофорез проводят при 200 V в течение 30 мин, пока краска не окажется на расстоянии 1-2 см от края геля.

Блотинг.

Подготовительные этапы:

·   необходимо смочить PVDF-мембрану (Millipore, Immobilon-P, 0,45 мкм) метанолом в течение нескольких секунд, затем поместить в буфер для блотинга на 10 мин;

·   камеру для блотинга следует наполнить охлаждённым (+4 °С) буфером для блотинга.

Состав буфера для блотинга (10х):

Трис	30,28 г
Глицин	144,13 г
Дистиллированная вода	до 1000 мл

Перед использованием к 100 мл 10х буфера для блотинга добавляют 900 мл дистиллированной воды и 100 мл метанола. Хранят при + 4 °С.

Сборка “сэндвича" для блотинга:

·   на губку помещают лист фильтровальной бумаги, смачивают его бидистиллированной водой, и наверх кладут мембрану;

·   извлекают гель из рамки, удаляют его верхнюю часть, содержащую прорези, и нижнюю часть ниже фронта краски. Гель аккуратно помещают на мембрану, избегая попадания пузырьков воздуха между ними. До 6 гелей может быть помещено на 1 мембрану размером 15 х 18 см;

·   наверх на гели кладут смоченный бидистиллированной водой лист фильтровальной бумаги, затем - губку;

·   Собранный “сэндвич” помещают в пластиковую кассету, закрывают её и помещают в камеру для блотинга. Кассету следует вставлять таким образом, чтобы PVDF-мембрана была обращена к положительному полюсу, а гели - к отрицательному (рис.9).

Блотинг проводят при 150 V в течение 1 часа при +4 °С при постоянном охлаждении.

Окраска белков. Мембрану удаляют и окрашивают связавшиеся с ней белки при помощи Ponceau S. Затем мембрану промывают буфером TBST до исчезновения красной окраски.

Состав буфера TBST:

NaCl	8,0 г
KCl	0,2 г
Трис	3,0 г
Дистиллированная вода	до 1000 мл
Твин-20	0,5 мл

буфера TBST доводят до 7,4 при помощи соляной кислоты.

Обработка антителами.

Блокирование. Для блокирования неспецифически связывающих участков мембраны её инкубируют с блокирующим буфером (5% раствор сухого молока в фосфатном буфере) в течение 0,5 часа при комнатной температуре с постоянным помешиванием на качающейся платформе.

Обработка первыми антителами. После блокирования неспецифически связывающих участков мембраны на неё наносят сыворотки, специфичные к прионному белку. Для этого используют:

поликлональные антисыворотки к тканям мозга крупного рогатого скота;

-   моноклональные антитела - 6Н4, SAF 70, F89/160.1.5.

Применение поликлональных антител снижает чувствительность реакции и ее специфичность из-за наличия в ней антител к тканям мозга, которые взаимодействуют с неразрушенными протеиназой К отдельными белками мозга крупного рогатого скота.

Для постановки реакции более эффективно использовать моноклональные антитела. Для этого 10 мкл мышиных моноклональных антител растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа (или 12-18 часов при +4 °С) с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 3 раза по 5 мин.

Детекцию реакции можно проводить путем использования антимышиных антител, меченных щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена.

Обработка коньюгатом со щелочной фосфатазой.1 0 мкл антител козла против иммуноглобулинов мыши, меченных щелочной фосфатазой растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 0,5 часа с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 5 раз по 5 мин.

Обработка коньюгатом с пероксидазой хрена. Проводится аналогично обработке коньюгатом со щелочной фосфатазой.

Проявление реакции.

Нанесение субстратной смеси для индикации щелочной фосфатазы. Мембрану помещают на 5 мин в 50 мл люминесцентного буфера. Растворяют 100 мкл CDP-Star (12,5 мМ, 50-кратный концентрат) в 5 мл люминесцентного буфера. Мембрану помещают на стекло, на её поверхность наносят 5 мл раствора CDP-Star, распределяют его равномерно по всей поверхности мембраны и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. С поверхности мембраны удаляют субстрат при помощи мягкой ткани. На мембрану в темноте или при красном свете накладывают рентгеновскую плёнку, помещают в светонепроницаемую кассету и выдерживают при комнатной температуре примерно 5 мин. Рентгеновскую плёнку проявляют и проводят интерпретацию полученных результатов.

Нанесение субстратной смеси для индикации пероксидазы хрена. Реакция визуализируется путем нанесения на мембрану субстратной смеси (раствор диаминобензидина 0,5 мг/мл и перикиси водорода 0,5 мг/мл в фосфатном буферном растворе pH 7,4) до появления полос. Реакция останавливается промыванием мембраны водой. После высушивания мембраны на воздухе проводится учет результатов.

Фосфатный буферный раствор 0,1 М, рН 7,4: