Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Принцип диагностики ГЭ крс с помощью иммуноблотинга ⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 2
Патологическая изоформа прионного белка (PrPSc) в отличие от всех остальных белков мозга устойчива к протеиназе К. Это свойство используется для его выделения: после обработки протеиназой К в пробе остаётся только PrPSc, если проба положительная, либо не остаётся никаких белков, если проба отрицательная. Для определения молекулярной массы белков пробы после обработки протеиназой К проводят их электрофорез в агаровом или полиакриламидном геле. Скорость перемещения белков в геле при электрофорезе зависит от их заряда и молекулярной массы. С целью упрощения иммунодетекции разделённые в электрофорезе белки переносят из гелей на мембрану при помощи процедуры блотинга. Принцип её заключается в том, что белки извлекаются из геля под действием электрического поля и сразу же адсорбируются на мембране. Для определения иммунологических свойств перенесенных на мембрану белков проводят обработку мембраны антителами, специфичными к PrPSc, затем промывают антивидовыми антителами, мечеными ферментом. При нанесении на мембрану субстратной смеси она разлагается ферментом с образованием окрашенного или люминесцирующего продукта реакции, в зависимости от вида применяемых ферментов и субстратных смесей. Если на мембране присутствует PrPSc, происходит связывание с ним вначале первых, а затем вторых антител. При разложении ферментом, коньюгированным со вторым антителом субстратной смеси, окрашенный, либо люминесцирующий продукт реакции образуется в месте расположения прионного белка. Таким образом, PrPSc выявляется в иммуноблотинге с учётом трёх характеристик: устойчивости к протеиназе К, определённого размера молекул при электрофорезе (27-30 kDa) и связывания со специфическим антителом. Техника постановки иммуноблотинга состоит из следующих этапов: Ø отбор проб; Ø гомогенизация пробы; Ø ферментное разрушение пробы; Ø электрофорез; Ø блотинг; Ø обработка антителами; Ø проявление реакции; Ø учёт реакции; Ø интерпретация результатов. Техника постановки иммуноблотинга
Отбор, гомогенизация и ферментное разрушение пробы. Отбор проб. Для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота используется продолговатый мозг животных. Отбор проб производится через отверстие затылочной кости с помощью специальной ложечки.
Гомогенизация. Кусочек продолговатого мозга из области задвижки массой 0,45-0,7 г помещают в 50 мл пробирку и с помощью весов определяют точный вес пробы. К кусочку мозга добавляют 10-кратный объём буфера для гомогенизации. Затем проба гомогенизируется в течение 1 мин при помощи гомогенизатора при 20000 об/мин. Ферментное разрушение. В связи с тем, что прион PrPSc устойчив к протеиназе К, важным моментом является его ферментация. Для этого в 96-луночный планшет с объемом лунки 0,2 мл для ферментного разрушения вносят по 100 мкл каждого гомогената, добавляют 10 мкл протеиназы К (20 ЕД/мл) и хорошо перемешивают пипетированием. Ферментное разрушение проводят при 48°С в течение 40 мин. После инкубации добавляют 10 мкл останавливающего раствора для остановки протеолитической реакции. Электрофорез. Принцип электрофореза белков в геле основан на явлении пространственного разделения белков при их движении в электрическом поле. Белки, как биополимеры, обладающие зарядом, перемещаются в электрическом поле в направлении противоположно заряженного полюса. При этом скорость миграции белков в геле зависит от их заряда и молекулярной массы. Поскольку эти характеристики различны у разных белков, методом электрофореза можно добиться разделения сложной белковой смеси на отдельные белки. Денатурация. Денатурация белков приводит к нарушению вторичной и третичной структур белка, “разворачиванию" молекулы. При этом заряд белка, его линейные размеры и, следовательно, скорость миграции белков в геле становятся прямо пропорциональны их молекулярной массе, что даёт возможность точно её определить, сравнивая электрофоретическую подвижность исследуемого белка с электрофоретической подвижностью белков с известной молекулярной массой. Для этого к разрушенным протеиназой К пробам добавляют PAGE-буфер по 100 мкл на лунку с целью подготовки проб для электрофореза, хорошо перемешивают пипетированием и инкубируют при 96°С в течение 5 мин. Контрольный образец инкубируют при 65°С в течение 2 мин. Старые пробы, которые уже были проинкубированы при 96°С в течение 5 мин, также инкубируют при 65°С в течение 2 мин.
Состав буфера для подготовки проб для электрофореза (40 мл): Нанесение исследуемых проб на гель. 10 мкл контрольного образца наносят на первую дорожку геля. На остальные дорожки наносят по 10 мкл исследуемых проб. Внутреннюю и наружную камеры электрофоретической камеры заполняют буфером для электрофореза NuPAGE MOPS/SDS и добавляют 500 мкл антиоксиданта (NOVEX) только во внутреннюю камеру (рис.7). Состав буфера для электрофореза: Электрофорез. Электрофорез проводят при 200 V в течение 30 мин, пока краска не окажется на расстоянии 1-2 см от края геля. Блотинг. Подготовительные этапы: · необходимо смочить PVDF-мембрану (Millipore, Immobilon-P, 0,45 мкм) метанолом в течение нескольких секунд, затем поместить в буфер для блотинга на 10 мин; · камеру для блотинга следует наполнить охлаждённым (+4 °С) буфером для блотинга. Состав буфера для блотинга (10х):
Перед использованием к 100 мл 10х буфера для блотинга добавляют 900 мл дистиллированной воды и 100 мл метанола. Хранят при + 4 °С. Сборка “сэндвича" для блотинга: · на губку помещают лист фильтровальной бумаги, смачивают его бидистиллированной водой, и наверх кладут мембрану; · извлекают гель из рамки, удаляют его верхнюю часть, содержащую прорези, и нижнюю часть ниже фронта краски. Гель аккуратно помещают на мембрану, избегая попадания пузырьков воздуха между ними. До 6 гелей может быть помещено на 1 мембрану размером 15 х 18 см; · наверх на гели кладут смоченный бидистиллированной водой лист фильтровальной бумаги, затем - губку; · Собранный “сэндвич” помещают в пластиковую кассету, закрывают её и помещают в камеру для блотинга. Кассету следует вставлять таким образом, чтобы PVDF-мембрана была обращена к положительному полюсу, а гели - к отрицательному (рис.9). Блотинг проводят при 150 V в течение 1 часа при +4 °С при постоянном охлаждении. Окраска белков. Мембрану удаляют и окрашивают связавшиеся с ней белки при помощи Ponceau S. Затем мембрану промывают буфером TBST до исчезновения красной окраски. Состав буфера TBST:
буфера TBST доводят до 7,4 при помощи соляной кислоты. Обработка антителами. Блокирование. Для блокирования неспецифически связывающих участков мембраны её инкубируют с блокирующим буфером (5% раствор сухого молока в фосфатном буфере) в течение 0,5 часа при комнатной температуре с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Обработка первыми антителами. После блокирования неспецифически связывающих участков мембраны на неё наносят сыворотки, специфичные к прионному белку. Для этого используют: поликлональные антисыворотки к тканям мозга крупного рогатого скота; - моноклональные антитела - 6Н4, SAF 70, F89/160.1.5. Применение поликлональных антител снижает чувствительность реакции и ее специфичность из-за наличия в ней антител к тканям мозга, которые взаимодействуют с неразрушенными протеиназой К отдельными белками мозга крупного рогатого скота. Для постановки реакции более эффективно использовать моноклональные антитела. Для этого 10 мкл мышиных моноклональных антител растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа (или 12-18 часов при +4 °С) с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 3 раза по 5 мин.
Детекцию реакции можно проводить путем использования антимышиных антител, меченных щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена. Обработка коньюгатом со щелочной фосфатазой.1 0 мкл антител козла против иммуноглобулинов мыши, меченных щелочной фосфатазой растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 0,5 часа с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 5 раз по 5 мин. Обработка коньюгатом с пероксидазой хрена. Проводится аналогично обработке коньюгатом со щелочной фосфатазой. Проявление реакции. Нанесение субстратной смеси для индикации щелочной фосфатазы. Мембрану помещают на 5 мин в 50 мл люминесцентного буфера. Растворяют 100 мкл CDP-Star (12,5 мМ, 50-кратный концентрат) в 5 мл люминесцентного буфера. Мембрану помещают на стекло, на её поверхность наносят 5 мл раствора CDP-Star, распределяют его равномерно по всей поверхности мембраны и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. С поверхности мембраны удаляют субстрат при помощи мягкой ткани. На мембрану в темноте или при красном свете накладывают рентгеновскую плёнку, помещают в светонепроницаемую кассету и выдерживают при комнатной температуре примерно 5 мин. Рентгеновскую плёнку проявляют и проводят интерпретацию полученных результатов. Нанесение субстратной смеси для индикации пероксидазы хрена. Реакция визуализируется путем нанесения на мембрану субстратной смеси (раствор диаминобензидина 0,5 мг/мл и перикиси водорода 0,5 мг/мл в фосфатном буферном растворе pH 7,4) до появления полос. Реакция останавливается промыванием мембраны водой. После высушивания мембраны на воздухе проводится учет результатов. Фосфатный буферный раствор 0,1 М, рН 7,4:
|
|||||||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2020-03-13; просмотров: 73; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.222.23.119 (0.015 с.) |