Электрические свойства белков. Механизм возникновения электрического заряда белков. Изоэлектрическая точка.

Электрические свойства белков определяются присутствием на их поверхности положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Наличие заряженных группировок белка определяет суммарный заряд белковой молекулы. Если в белках преобладают отрицательно заряженные аминокислоты, то его молекула в нейтральном растворе будет иметь отрицательный заряд, если преобладают положительно заряженные – молекула будет иметь положительный заряд.

При увеличении кислотности среды происходит уменьшение на поверхности молекулы белка числа отрицательно заряженных и увеличение числа положительно заряженных групп. Совсем другая картина наблюдается при снижении концентрации ионов водорода и увеличении концентрации гидроксид-ионов. Число диссоциированных карбоксильных групп возрастает и снижается число протонированных аминогрупп

Изоэлектрическая точка (pI) — кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда. Амфотерные молекулы (цвиттер-ионы) содержат как положительные, так и отрицательные заряды, наличием которых определяется pH раствора

Изоэлектрическая точка для большинства белков находится в области рН от 4,5 до 6,5. Однако есть и исключения. При значениях рН ниже изоэлектрической точки белок несет суммарный положительный заряд, выше – суммарный отрицательный.

В изоэлектрической точке растворимость белка минимальна, так как его молекулы в таком состоянии электронейтральны и между ними нет сил взаимного отталкивания, поэтому они могут «слипаться» за счет водородных и ионных связей, гидрофобных взаимодействий, ван-дер-ваальсовых сил. При значениях рН, отличающихся от рI, молекулы белка будут нести одинаковый заряд - либо положительный, либо отрицательный. В результате этого между молекулами будут существовать силы электростатического отталкивания, препятствующие их «слипанию», растворимость будет выше.

Механизм возникновения заряда Молекула белка имеет электрический заряд, обусловленный почти исключительно диссоциацией ионогенных групп —СООН и —NH2 иона, одновременно обладающего положительными и отрицательными зарядами (амфиона), совершается за счет перехода протона из карбоксильной группы в аминогруппу:Заряд белковой молекулы в нейтральной среде определяется соотношением количества свободных групп —СООН и — NH2 и степенью их диссоциации.

12.Количественные методы определения белка. Принцип определения содержание белка крови биуретовым методом. Нормальное содержание белка крови. Гипо, гиперпротсинемия. Белковый коэффициент крови.

Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:

● спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

● рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

● нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

● поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

Биуретовый метод — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе. Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность раствора (прямо пропорциональную концентрации пептида) определяют при 540—560 нм.

К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.

Референсные значения нормального содержания белка крови.

0 - 7 мес.=44 – 76 г/л 1 - 3 года=56 - 75 г/л 3 - 18 лет=60 - 80 г/л > 18 лет=64 - 83 г/л

Результаты анализа на общий белок в сыворотке крови позволяют оценить состояние здоровья, рациональность питания и функцию внутренних органов по эффективности их работы в отношении поддержания нормального белкового обмена. Если выявлено отклонение от нормы, для уточнения его причины требуется дальнейшее обследование.

Гипопротеинемия – уменьшение содержания общего белка крови. Наблюдается при кровотечениях, злокачественных новообразованиях, нарушениях функции почек, печени, голодании и др.

Гиперпротеинемия – повышение содержания общего белка крови.

Относительная гиперпротеинемия связана с потерей воды, а, следовательно, повышением концентрации общего белка (поносы, рвота, сахарный и несахарный диабет, холера, дизентерия).

Абсолютная гиперпротеинемия возникает вследствие повышенного образования белков, например, образование γ-глобулинов при инфекционных заболеваниях.

Значительно большее диагностическое значение, чем изменения абсолютного количества альбуминов и глобулинов имеют нарушения их соотношений, так называемый белковый коэффициент крови, являющийся результатом отношения альбуминовой фракции белков крови к глобулиновой. В нормальных условиях белковый коэффициент крови у здорового человека колеблется в пределах от 1,2 до 2,2.

Из физиологических моментов, ведущих к снижению белкового коэффициента, следует указать на беременность, голодание, в то время как прием пищи, богатой белками, обусловливает увеличение коэффициента.

Уменьшение белкового коэффициента крови ниже 1,2 (ниже 1,0), свидетельствует о значительных сдвигах, происшедших в "белковой формуле" крови; и чаще всего является результатом одновременно абсолютного уменьшения альбуминовой фракции при относительном нарастании глобулинов. Подобное уменьшение белкового коэффициента встречается при болезнях печени, в частности при паренхиматозных гепатитах, циррозах, гепато-ренальном синдроме.

При этом при нефрозах сдвиги коэффициента зависят от степени выраженности процесса. Выраженное снижение коэффициента описано при алиментарной дистрофии и вторичных истощениях, в том числе и раневой дистрофии. Понижение коэффициента встречается и при раковой кахексии, при распадах белков в организме. Также характерно это для инфекционных, воспалительных и гнойных процессов.

13.Принципиальная схема устройство и работа фотоэлектроколориметра. Способ определения концентрации веществ с помощью калибровочного графика.