Культуры клеток и тканей. Способы витального микроскопического исследования. Методы окрашивания гистологических препаратов 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Культуры клеток и тканей. Способы витального микроскопического исследования. Методы окрашивания гистологических препаратов



КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, метод сохранения в жизнеспособном состоянии клеток, участков тканей, органов или их частей вне организма. Во 2-й пол. 19 в. развитие микробиологии, прежде всего медицинской (необходимость выделения и изучения микробов, вызывающих инфекционные болезни), а также производств, основанных на процессах брожения (виноделие и др.), привело к созданию методов культивирования клеток бактерий, дрожжей и других микроорганизмов, т. е. методов их выделения, выращивания, размножения и сохранения в искусственных условиях. Были разработаны составы жидких и твёрдых питательных сред, методы, обеспечивающие их стерильность, способы выращивания чистых культур, состоящих из клеток одного вида, и т. д. К сер. 20 в. было освоено культивирование микроорганизмов в промышленных масштабах.

Первые опыты по выращиванию клеток и тканей животных вне организма были сделаны в нач. 20 в. Дальнейшее совершенствование метода шло параллельно успехам цитологии, биохимии, генетики, эмбриологии, молекулярной биологии. Его возможности возросли после того, как научились получать изолированные клетки из различных животных тканей (путём их обработки специальными ферментами, растворяющими межклеточное вещество и разрушающими межклеточные контакты) и выяснили потребности разных клеток в гормонах, факторах роста и др. веществах, вносимых в искусственные питательные среды. Очевидные преимущества работы с генетически однородными клетками и тканями в контролируемых условиях вне организма по сравнению с проведением исследований на целых организмах сделали этот метод одним из наиболее универсальных в биологии. Столь же плодотворным оказалось его применение в медицине и при решении ряда задач сельского хозяйства и биотехнологии.

Клеточные и тканевые культуры использовались для изучения закономерностей митоза и числа клеточных циклов (делений) у клеток разных типов и выяснения в связи с этим «запрограммированности» процесса старения, для изучения механизмов клеточной дифференцировки, формирования специализированных тканей и органов, а также (при совместном культивировании) влияния друг на друга клеток разных типов. Культура клеток и тканей растений появилась позднее – в 1958 г., но уже всего через 6 лет из единственной клетки, извлечённой из корня моркови, удалось в условиях культуры вырастить целое растение с дифференцированными тканями и органами. Это направление широко применяется в селекции и биотехнологии.

Совместное культивирование клеток разных линий (клонов) привело к рождению нового важного раздела в экспериментальной биологии – генетики соматических клеток и прежде всего метода гибридизации соматических клеток.

Клеточные и тканевые культуры позволяют исследовать такие важные для медицины проблемы, как перерождение нормальных клеток в опухолевые, всесторонне изучать их свойства, чувствительность клеток к физическим и химическим факторам, в т. ч. к лекарствам, а также определять потенциальную мутагенность и канцерогенно-сти этих факторов, т. е. их способность вызывать мутации и опухоли. Разработка методов длительного культивирования позволяет формировать банки клеточных линий, обладающих определёнными генетическими и биохимическими свойствами. На этой основе создаются методы криоконсервации (от греч. «криос» – холод) – сохранение в условиях глубокого охлаждения клеток, тканей и органов для трансплантации (пересадки), в качестве резервного генофонда редких и исчезающих биологических видов, а также для других целей. С кон. 20 в. стали возникать банки, в которых хранятся замороженные стволовые клетки, используемые для лечения самых различных болезней и травм.

Клеточные культуры служат также удобными объектами для изучения тканевой несовместимости и других иммунных реакций. Они используются в диагностике вирусов и для получения вакцин. Таким образом, культура клеток и тканей применяется для решения как фундаментальных теоретических проблем (таких, напр., как клеточная дифференцировка), так и различных практических задач, особенно в области медицины. Этот метод – неотъемлемая составная часть генной инженерии, клеточной инженерии, клонирования и других направлений экспериментальной биологии.

Микроскопические методы исследования — способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет световая и электронная микроскопия. В практической и научной деятельности врачи различных специальностей — вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света. При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов.

Для световой микроскопии и основанных на ней других М.м.и. определяющее значение помимо разрешающей способности микроскопаимеет характер и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света — его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные М.м.и. Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1). При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный конденсор, который встраивают в микроскоп.

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. Объектив специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку. Живые микроскопические объекты или фиксированные, но не окрашенные микроорганизмы и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цвет проходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя через изучаемый объект, лучи света отклоняются от полупрозрачной фазовой пластинки. В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1/4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

 

В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания.

Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов.

В гистологической практике применяют основные, кислотные и нейтральные красители. Основные, или ядерные, красители — это основания или их соли, которые окрашивают структуры кислой природы (хроматин ядер, ядрышко и др.) и называются базофильными. К ним относятся гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый и др. Кислотные красители — это кислоты или их соли, с помощью которых выявляют вещества и структуры основной природы (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.). Таковыми являются эозин, кислый фуксин, Конго красный (конгорот), эритрозин. Нейтральные красители: судан III, судан IV, метиленовый синий. Процесс гистологического окрашивания условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный, прямой и непрямой, простой и сложный. При прогрессивном типе окрашивания процесс идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение красителя в ткань. Регрессивный тип основан на первоначальном перекрашивании структур с последующей дифференцировкой до нужного уровня. Если раствор красителя непосредственно действует на ткань, то говорят о прямом окрашивании. Окрашивание после предварительной подготовки ткани (протравливания) называется непрямым. Окрашивание одним красителем - простое, а при использовании нескольких красителей — сложное.

Для получения оптимальных результатов окрашивания гистологических препаратов нужно использовать растворы, приготовленные в точном соответствии с рекомендуемой прописью. Перед приготовлением нужно внимательно осмотреть реактивы, так как возможны изменение цвета, окисление, кристаллизация и т.п. По мере инактивации, разбавления и изменения концентрации растворов красителя при длительном использовании его необходимо своевременно заменять свежим. Для хранения красителей и проведения окраски применяют химически чистую маркированную посуду. После приготовления новых порций красителя, особенно при использовании различных партий реактивов окраску нужно контролировать под микроскопом. Продолжительность окрашивания реактивами различных фирм варьирует.



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2019-05-20; просмотров: 370; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 52.91.255.225 (0.004 с.)