Субстанции по градуировочному (калибровочному) графику

    Способ расчета основан на сравнении оптической плотности раствора анализируемого вещества с оптической плотностью раствора стандартного образца (СО) на градуировочном (калибровочном) графике. Градуировочный (калибровочный) график отражает зависимость оптической плотности раствора стандартного образца анализируемого вещества от его концентрации.

Стандартные  образцы (СО) – это вещества, применяемые для сравнения физико-химических характеристик испытуемых ЛС при проведении анализа согласно соответствующей спецификации (ФС, ФСП, ГФ, НД).

    Для построения градуировочных графиков в качестве стандартного образца используют государственные стандартные образцы (ГСО) или рабочие стандартные образцы (РСО).

ГСО представляет собой фармацевтическую субстанцию (первичный стандарт), соответствующую требованиям ФС на указанный ГСО. Согласно НД (ГФ, ФС, ФСП) ГСО используют в анализе фармацевтических субстанций физико-химическими и биологическими методами

РСО представляет собой фармацевтическую субстанцию, откалиброванную путем сравнения со вторичным стандартном (ФС или ФСП на субстанцию). В качестве РСО для анализа дозированных лекарственных форм разрешается использовать образец серийной субстанции, отвечающий требованиям НД (ГФ, ФС, ФСП).

    Для построения градуировочного (калибровочного) графика готовят стандартный раствор. Для этого отвешивают на аналитических весах точную навеску фармацевтической субстанции (ГСО или РСО) (а, г), вносят в мерную колбу вместимостью W, мл,  растворяют, доводят растворителем до метки содержимое колбы, перемешивают (раствор А).

    Для приготовления разведений отмеривают калиброванной пипеткой определенные объемы (V, мл) раствора А, вносят в мерную колбу вместимостью W _i, мл, доводят объем мерных колб до метки растворителем, перемешивают (серия растворов В).

Измеряют оптическую плотность полученных растворов серии В относительно растворителя на спектрофотометре (фотоэлектроколориметре) при аналитической длине волны, указанной в НД, в кюветах с оптимальной толщиной слоя. Полученные значения оптической плотности используют для построения градуировочного (калибровочного) графика.

    Раствор анализируемого вещества готовят так, чтобы его оптическая плотность находилась в интервале 0,2–0,8 (оптимальное значение, позволяющее с наибольшей точностью измерить светопоглощение). Измеряют в тех же условиях оптическую плотность (А_х) анализируемого раствора. По калибровочному графику определяют содержание действующего вещества в анализируемом растворе, а затем пересчитывают его на исходный образец, учитывая схему разведения (g).

        

 

ПРИМЕР: Определите содержание рибофлавина в порошках состава: Рибофлавина 0,005, Сахара 0,1 методом фотоколориметрии, используя способ расчета по калибровочному графику.

    Методика: 0,02 г (a₁) порошка растворяют в 10,0 мл (W₁) воды при нагревании на водяной бане, охлаждают. К 1,0 мл (V) раствора прибавляют 9,0 мл (W₂) воды, перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученного раствора (А_х) на ФЭК при длине волны 445 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно воды.

    Для приготовления стандартного раствора 0,0100 г (а_ст) рибофлавина, соответствующего требованиям ФС, растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 250,0 мл (W₃) при нагревании на водяной бане, охлаждают. Доводят объем раствора водой до метки, перемешивают (1,0 мл стандартного раствора содержит 0,00004 г рибофлавина).

    Для построения градуировочного (калибровочного) графика готовят серию стандартных разведений: в колбы вносят соответственно 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мл (V_i) стандартного раствора, доводят объем раствора водой до 10,0 мл (W₄), перемешивают. Измеряют оптическую плотность на ФЭК при длине волны 445 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно воды.

Значения оптической плотности анализируемого раствора (А_х) равно 0,48; серии стандартных разведений – соответственно 0,09; 0,18; 0,27; 0,36; 0,45; 0,54.

    РЕШЕНИЕ: По полученным значениям оптических плотностей стандартных разведений строят калибровочный график (рис.3), предварительно рассчитав концентрации серии стандартных разведений согласно схеме их приготовления:

 

 

Для удобства расчета концентрацию стандартных растворов выражают в г/мл; г/10 мл; %. Например, концентрация стандартного раствора рибофлавина в г/10 мл равна:

 

Концентрация того же раствора в г/мл и % соответственно равна:

 

 

 

                                

  Рисунок 3 – Калибровочный график стандартного раствора рибофлавина

 

С помощью градуировочного (калибровочного) графика по значению оптической плотности анализируемого раствора (А_х) методом интерполяции находят концентрацию стандартного раствора (С_х) с равным значением оптической плотности. Найденное значение С_х пересчитывают на массу порошка по прописи (Р) по формуле 3.25:

 

                  (3.25)

 

где C_х – концентрация стандартного раствора со значением оптической плотности, равным оптической плотности анализируемого раствора (найдена по калибровочному графику), г/мл, %, г/10 мл; W₁; W₂ – соответственно вместимость мерных колб, использованных для приготовления анализируемого раствора, мл; V – аликвота  для приготовления фотометрируемого раствора, мл; a₁ – навеска (объем) лекарственной формы, взятая на анализ, г (мл); Р – масса (объем) лекарственной формы по прописи, г (мл).

 

Независимо от градуировки калибровочного графика – концентрация стандартного раствора по оси ординат г/мл (1); % (2); г/10 мл (3) – содержание анализируемого вещества (g, г) составляет:

        (1)

                 (2)              

             (3)

ОТВЕТ: Содержание рибофлавина в порошках – 0,0055 г.

 

 

Расчет по градуировочному (калибровочному) графику удобен при проведении серийных анализов окрашенных веществ (рибофлавин, фурацилин (нитрофурантоин) и др.) в условиях заводского или аптечного производства. Градуировочный (калибровочный) график нужно периодически проверять (один раз в месяц), т.к. удельный показатель поглощения и оптическая плотность зависят от температуры окружающей среды.       

Достоинства расчета по калибровочному графику:

♦ простота и удобство при рутинном анализе однотипных по химическому составу растворов (серийные фотометрические анализы);

♦ возможность проводить количественное определение анализируемого вещества при несоблюдении закона Бугера-Ламберта-Бера. В этом случае градуировочный (калибровочный) график строят для узкого интервала концентраций, в пределах которого зависимость оптической плотности наиболее линейна.

Недостатки:

♦ появление погрешностей, связанных с субъективностью построения калибровочного графика, несоответствием графических (масштабных) погрешностей, погрешностей измерений оптических плотностей, связанных с изменением условий (например, температуры) и невоспроизводимостью установки длины волны.

    В то же время расчет количественного содержания ЛВ в анализируемом образце по уравнению градуировочного (калибровочного) графика позволяет получить наиболее точные результаты.