ТОП 10:

Основные принципы цитогенетического анализа в пренатальной диагностике



При пренатальном кариотипировании следует руководствоваться рекомендациями, принятыми в отечественной и международной клинической цитогенетике, а также нормативными документами МЗ РФ (Приказ МЗ РФ № 316 от 30.12.1993). Заключение о кариотипе должно соответствовать правилам Международной номенклатуры хромосом.

Программы контроля качества цитогенетических исследований в учреждениях медико-генетической службы включают состав и квалификацию персонала, оборудование и реактивы, а также ряд параметров, касающихся непосредственного выполнения хромосомного

анализа.

В связи с увеличением числа центров ПД, а также отсутствием единой системы контроля качества, представляется целесообразным рассмотреть основные требования к организации работы цитогенетических подразделений, обратив особое внимание на критерии качества пренатального кариотипирования.

Состав и квалификация персонала

Согласно нормативам (Приказ МЗ РФ № 316 от 30.12.1993), цитогенетическая пренатальная диагностика осуществляется коллективом, состоящим из специалистов с высшим и средним специальным образованием. При этом штатная структура цитогенетического подразделения должна иметь не менее двух ставок врачей-цитогенетиков и соответствующее им число ставок фельдшеров-лаборантов. При этом каждый врач-цитогенетик должен выполнить 160 пренатальных кариотипов в год.

Оборудование

Необходимым условием точности проводимых исследований является соответствующее им лабораторное оборудование, контроль и сертификация которого осуществляются по определенной схеме.

Реактивы

Следует особо подчеркнуть, что необходимо заблаговременно проверять качество всех реактивов, используемых для приготовления рабочих растворов. Во избежание повторных технических ошибок рекомендуется учитывать и анализировать их характер и частоту в режиме лабораторной базы ошибок.

Показатели качества цитогенетических исследований Число анализируемых метафаз.

Для препаратов из культур клеток достаточным считается наличие 20-50 метафазных пластинок на предметное стекло. Качество «прямых» препаратов из цитотрофо-бласта хориона или плаценты, как отмечалось выше, можно считать удовлетворительным, если на стекле присутствует более 10 метафаз, пригодных для подсчета и анализа структуры хромосом. При этом независимо от способа приготовления препаратов разброс хромосом признается хорошим, если наложения хромосом отсутствуют или представлены небольшим числом (1-2) в более 80 % пластинок, и плохим, если многочисленные наложения хромосом встречаются более чем в 20 % метафаз.

Качество окраски.

Для ориентировочной оценки уровня разрешения рекомендуется произвести подсчет числа G-сегментов в хромосомах 1 и 2 с умножением полученной суммы на 6. Качество окраски признается хорошим, если ее четкость при уровне разрешения ~ 550 сегментов позволяет идентифицировать четыре G-сегмента на 18q и 3 — на 11p, 7q33 и 7q35, особенно если удается визуализировать сегмент 22ql3.2. Такой уровень (400-550 сегментов на гаплоидный набор) достаточен для стандартного кариотипирования. Для анализа микроперестроек хромосом требуется более высокое разрешение (> 800 сегментов), которое достигается при использовании репликационных вариантов дифференциального окрашивания.

Время анализа.

Промежуток времени от момента получения плодного материала до постановки цитогенетического диагноза зависит от методических особенностей выполняемого исследования, пропускной способности лаборатории, диагностической сложности конкретного случая, необходимости уточняющих лабораторных мероприятий и т. д. Оптимальным для кариотипирования по клеткам ворсин хориона является срок 3-7 дней, клеток амниотической жидкости— 10-16 дней, лимфоцитов пуповинной крови— 4-7 дней. Большую часть времени составляет этап культивирования, тогда как собственно анализ хромосомных препаратов в стандартном режиме занимает 1-1,5 рабочих дня. Однако реальные сроки цитогенетической диагностики могут варьировать в широком диапазоне Так, высокотехнологичный и продуктивный метод FISH позволяет проводить анализ по интерфазным ядрам на препаратах некультивированных клеток за 1-2 дня. Этот метод широко используется за рубежом для экспресс-диагностики наиболее распространенных анеуплоидий. Увеличение времени анализа, оптимального для каждого метода, обусловлено либо техническими, либо диагностическими проблемами. К техническим проблемам можно отнести низкий митотический индекс и неудовлетворительное качество метафазных пластинок, что требует просмотра всех полученных препаратов. Возможные неудачи при цитогенетическом исследовании обусловлены, как правило, отсутствием метафазных пластинок, пригодных для анализа. Средние стандарты технических (неполучение результата при наличии жизнеспособных клеток) и культуральных (отсутствие адекватного роста клеток) неудач при кариотипировании по клеткам амниотической жидкости и хориона составляют 1,5 и 2 % соответственно, а по лимфоцитам периферической крови— 5%. Накопленный нами опыт (более 8000 пренатальных диагностик) показывает, что результативность анализа по клеткам цитотрофобласта на «прямых» препаратах из хориона и плаценты, а также по ФГА-стимулированным лимфоцитам пуповинной крови оказывается выше (в среднем 99,8 %). Причины невозможности проведения цитогенетического анализа в 0,2-0,4 % случаев были рассмотрены нами в соответствующих разделах. Вместе с тем, отсутствие или недостаточное число метафаз на «прямых» препаратах далеко не всегда связано с нехваткой материала, полученного при хорион- или плацентобиопсии. Однако вес образца должен составлять > 10 мг для ускоренного метода и > 15 мг для кратковременных культур, а в случае совмещения прямых методов с культивированием клеток в монослое — > 30 мг.

Диагностическим проблемам и способам их решения посвящен специальный раздел этой главы. Отметим только, что сложные случаи требуют не только применения дополнительных методик для уточнения первичного цитогенетического заключения, но и кариотипирования родителей, что задерживает постановку цитогенетического диагноза как минимум на неделю.

Правила кариотипирования.

Заключение о кариотипе должно базироваться на идентификации и анализе структуры всех хромосом на 2-3 метафазных пластинках. Для заключения о кариотипе минимальное число пластинок должно составлять 11-15. Такой объем исследования позволяет исключить хромосомный мозаицизм с вероятностью более 95 %. Мозаичная форма геномных мутаций устанавливается при наличии не менее двух клеток с однотипным изменением кариотипа, что требует увеличения размера анализируемой выборки (подробнее о статистических проблемах диагностики мозаицизма.

Следует отметить, что системы анализа изображений с программным обеспечением для кариотипирования целесообразно использовать в интерактивном режиме. Ни одна из существующих в настоящее время программ для автоматического кариотипирования не является совершенной, и любая предложенная в автоматическом режиме кариограмма нуждается в проверке. Разница между программами состоит только в числе ошибок в кариограмме, полученной при автоматической раскладке идеальных метафазных пластинок с хорошим разбросом и отличной G-окраской хромосом. Как правило, требуется коррекция 2-5 и более ошибок, вызванных неправильным распознаванием гомологичных и негомологичных хромосом и неадекватным размещением их в ячейках раскладки. Следует напомнить, что под кариотипом понимают совокупность морфологических особенностей полного хромосомного набора единичной соматической клетки. Поэтому в кариограмме, которая является систематизированной характеристикой кариотипа, должны быть представлены гомологичные хромосомы, идентифицированные на одной метафазной пластинке. Недопустимо использовать при составлении кариограммы хромосомы, принадлежащие разным наборам, т. е. из разных клеток.







Последнее изменение этой страницы: 2019-04-27; Нарушение авторского права страницы

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.227.233.6 (0.007 с.)