Постановка реакції зв’язування комплементу (РЗК) з метою виявлення антитіл в досліджуваній сироватці.

Реакція зв’язування комплементу заснована на здатності специфічного комплексу антиген+антитіло адсорбувати (зв’язувати) комплемент. Оскільки процес зв’язування комплементу не проявляється візуально, то як індикатор використовується гемолітична система (еритроцити барана + гемолітична сироватка), яка свідчить про наслідки реакції між антигеном і антитілом. Якщо антиген і антитіло відповідають один одному, то комплемент зв’язується цим комплексом і гемоліз не проходить, а якщо комплекс не утворюється, то наступає гемоліз.

РЗК відноситься до складних серологічних реакцій і для її здійснення необхідно не менше 5 інгредієнтів: антиген, антитіло і комплемент (перша система), еритроцити барана і відповідна їм гемолітична сироватка.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ОСНОВНОГО ДОСЛІДУ РЕКЦІЇ ЗВ’ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (РЗК) З МЕТОЮ ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ В ДОСЛІДЖУВАНІЙ СИРОВАТЦІ

№ пробірок Інгредієнти (в мл)	Дослідна	Контрольні
Досліджувана сироватка (1:10)	0,5	---	0,5	0,5	---	---
Антиген в робочій дозі	0,5	0,5	---	0,5	0,5	0,5
Комплемент в робочій дозі	0,5	0,5	0,5	---	0,5	0,5
Сироватка завідомо позитивна (1:10)	---	---	---	---	0,5	---
Сироватка завідомо негативна (1:10)	---	---	---	---	---	0,5
Ізотонічний розчин NaCl	---	0,5	0,5	0,5	---	---
В термостат на 2 години при 37^0
Гемолітична система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
В термостат на 1 годину при 37^0

5.3. Провести ідентифікацію культури грибів роду Candida, що забарвлені імунною сироваткою, міченою флуорохромом, в препараті за допомогою реакції імунофлуоресценції (РІФ) (демонстраційна робота). Зробити висновок.

При постановці прямої РІФ досліджуваний матеріал (культури грибів роду Candida) бактеріологічною петлею наносять на знежирене предметне скло, готують тонкий мазок, висушують його на повітрі, фіксують. На зафіксований препарат наносять 1-2 краплі флуоресціюючої сироватки і фарбують його у вологій камері 20-30 хв. при 25⁰ С. Після інкубації препарат промивають 2-4 рази забуференим ізотонічним розчином, впродовж 10-15 хв. прополіскують дистильованою водою, висушують, наносять краплю нефлуоресціюючої олії і розглядають в люмінесцентному мікроскопі за допомогою імерсійного об’єктиву. При цьому гриби роду Candida дають яскраве світіння на темному фоні.

 

5.4. Провести облік ІФА, що була поставлена з метою виявлення НВsAg у сироватці крові хворих з підозрою на вірусний гепатит В (демонстраційна робота).

Наявність і активність ферменту, зв’язаного з антитілом чи комплексом антиген-антитіло виявляють і оцінюють візуально за інтенсивністю забарвлення після інкубації з відповідним субстратом.

 

Питання для самоконтролю.

· На якому принципі заснована реакція зв’язування комплементу; в чому її переваги перед іншими серологічними реакціями?

· Які серологічні реакції можна застосувати з метою експрес-діагностики інфекційних захворювань?

· Які перспективи і аспекти використання моноклональних антитіл? Чому в серологічних реакціях з мітками віддається перевага саме моноклональним антитілам?

· В чому полягають принципи прямої та непрямої РІФ, ІФА, РІА, які переваги та недоліки цих методів?

 

Практичне заняття №14

Тема: «Вакцини та імунні сироватки».

1.Актуальність теми:

В загальному комплексі протиепідемічних заходів велику роль надають специфічній профілактиці і терапії інфекційних захворюванню. Особливе значення в цьому мають вакцини, імунні сироватки і імуноглобуліни, які в різний час врятували життя мільйонам людей. Вакцини і анатоксини сприяють формуванню активного проти інфекційного імунітету, мобілізуючи механізми імунологічної пам’яті. Введення імунних сироваток і імуноглобулінів створює негайний пасивний гуморальний імунітет, здатний захистити організм від інтоксикації або інфекції. Діагностичні імунні сироватки використовують для визначення антигенної структури збудника і його серологічної ідентифікації для встановлення етіології інфекційного захворювання.

Студентам надається можливість ознайомитись з лікувально-профілактичними і діагностичними препаратами, які використовуються в медицині, засвоїти принципи їх отримання, методи стандартизації і контролю.

Це зумовлює актуальність теми заняття, яка спрямована на формування позитивної мотивації її вивчення.

2. Конкретні цілі:

· Аналізувати принципи одержання вакцинних препаратів, дати порівняльну характеристику кожному з них, вивчити методи їх стандартизації і контролю, практичне використання.

· Ознайомитись з вакцинами. Що вживаються в медичній практиці, принципи їх класифікації.

· Оволодіти принципами виготовлення імунних сироваток, методами їх стандартизації, контролю, практичне значення.

 

Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №10.

4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.

4.1. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

4.2.

Термін	Визначення
Імунопрофілактика	Профілактика інфекційних захворювань шляхом створення імунітету до них за допомогою імунологічних методів – активної і пасивної імунізації.
Імунотерапія	Лікування хворих шляхом впливу на систему імунітету.
Вакцини	Біологічні препарати, одержані з мікроорганізмів, продуктів їх життєдіяльності, синтетичної, генно-інженерної аналогії, або антиідіотипові антитіла, які використовують з метою активної імунізації людей для профілактики і терапії інфекційних захворювань.
Аттенуація	Стійке незворотне послаблення вірулентності патогенних мікроорганізмів, використовується для отримання вакцинних штамів.
Вакцина жива	Вміщує життєздатні штами патогенного мікроорганізму з максимально зниженою вірулентністю, але збереженими антигенними властивостями, яка створює напружений імунітет, схожий з постінфекційним.
Вакцина інактивована	Виготовлена з мікроорганізмів, що мають виражені імуногенні властивості, ін активована (вбита) дією фізичних і хімічних факторів.
Вакцина хімічна	Складається з специфічних антигенів, що вилучені з мікроорганізмів і очищені від баластних речовин.
Анатоксин	Якісно новий препарат, отриманий з екзотоксину шляхом дії 0,3% розчину формаліну при температурі 37°С протягом 30 днів.
Вакцина генно-інженерна	Отримана на основі картрування геномів мікроорганізмів: гени, що контролюють потрібні антигенні детермінанти, переносять в геном інших мікроорганізмів і клонують в них, сприяючи експресії цих генів в нових умовах.
Анти ідіотипові антитіла	Вакцини, отримані на основі антиідіотипових антитіл, що характеризуються близькою структурою між епітопом антигена і активним центром антиідіотипового антитіла.
Імунні сироватки	Сироватка крові, отримана від людини або тварини, які були імунізовані якимсь антигеном і містить антитіла до цього антигена, використовується в якості лікувального або діагностичного засобу.
Флокуляція	Різновид реакції преципітації в рідині, при якій комплекси антиген-антитіло (найчастіше токсин-анатоксин) утворюють видимі преципітати (флокулянти), що можна характеризувати кількісно.
Сила анатоксину	Найменша кількість анатоксині, яка вступає в реакцію флокуляції в ініціальній пробірці з однією антитоксичною одиницею антитоксичної сироватки при температурі 45°С.
Ініціальна пробірка	Пробірка, що вміщує еквівалентну кількість анатоксину і антитоксину, в ній вперше з’являється опалесценція або дрібнодисперсний осад.

 

4.3. Теоретичні питання до заняття:

· Історія розвитку імунопрофілактики та імунотерапії інфекційних захворювань.

· Принципи отримання, методи стандартизації і характеристика вакцин першого покоління – живих і ін активованих.

· Принципи одержання, методи стандартизації і характеристика вакцин другого покоління – хімічних і анатоксинів.

· Генно-інженерні вакцини, анти ідіотипові антитіла, теоретичні основи для їх створення, властивості, перспективність використання.

· Імунні сироватки і імуноглобуліни, принципи отримання, практичне значення.

· Методи контролю вакцинних препаратів і препаратів із сироваток.

 

4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:

· Ознайомитись з вакцинами, що вживаються в медицині, визначити їх властивості, переваги і недоліки, практичне застосування.

· Вивчити принципи одержання лікувально-профілактичних і діагностичних сироваток, використання в медицині.

· Засвоїти методику визначення сили анатоксину в флокуляційних одиницях.

· Аналізувати методи контролю вакцинних і сироваткових препаратів.

 

5. Зміст теми:

На практичному занятті студенти вивчають принципи класифікації, методи отримання різних імунопрофілактичних, лікувальних, діагностичних препаратів, що вживаються в медицині, їх властивості, переваги і недоліки. Засвоюють принципи стандартизації і контролю їх. Оволодіють методом визначення сили анатоксину за допомогою реакції флокуляції. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.