Структурные и функциональные изменения важнейших биомолекул при воздействии ионизирующих излучений

В цепи радиационно-химических превращений в органических молекулах биосубстрата наибольшее значение для дальнейшей судьбы облученной клетки имеют процессы, происходя- щие в белках, ДНК и фосфолипидах. Показано, в частности, что в условиях доступа кислорода и воды свободные радикалы могут вызывать нарушения структуры белков — разрывы дисульфид- ных мостиков, водородных связей, пептидной цепи, образование сшивок между пептидными це- пями, окисление сульфгидрильных групп и ароматических аминокислот и т. д. Результатом этих радиационно-индуцированных процессов является изменение вторичной и третичной структуры белков, ведущее, в свою очередь, к нарушению их биологических свойств, в том числе фер- ментативной активности.

Радиационные повреждения ДНК, обусловленные ее радиолизом, проявляются, главным образом, в виде нарушений структуры азотистых оснований, появлений одно- и двунитевых раз- рывов ДНК, щелочно-лабильных сайтов, сшивок ДНК—ДНК и ДНК—белок, нарушений ком- плексов ДНК с другими молекулами. В косвенном действии радиации на ДНК основную роль иг- рает гидроксильный радикал ОН', вызывающий радиолиз азотистых оснований и дезоксирибозо- фосфатного фрагмента ДНК. Облучение вызывает деконденсацию хроматина, обусловленную лабилизацией связей ДНК-гистон и облегчающую доступность ДНК к действию агентов, фикси- рующих ее повреждение.

В пострадиационном повреждении ДНК особенно велика роль «кислородного эффекта». В присутствии кислорода число повреждений оснований ДНК увеличивается более чем в три раза, в несколько раз возрастает интенсивность образования щелочелабильных связей в тяжах ДНК, в 2—2,5 раза увеличивается количество однонитевых и двойных разрывов ДНК.

Кислород участвует в цепных радикальных реакциях перекисного окисления липидов (ПОЛ). В «нормальных» (физиологических) условиях удержание реакций ПОЛ на стационарном уровне обеспечивается различными механизмами антиоксидантной защиты. Несостоятельность или снижение эффективности антирадикальной и антиперекисной защиты, отмечающиеся после облучения, могут способствовать длительному протеканию процессов ПОЛ в липидном бислое клеточных мембран и последующему нарушению их структуры и функции. В определенных кон- центрациях продукты ПОЛ могут оказывать токсичный эффект на биомембраны, изменять отно- сительный химический состав фосфолипидов мембран, их вязкость, проницаемость, многие фи- зико-химические характеристики (электрокинетический потенциал, рецепция, мембраносвязан- ные тиогруппы и т. д.), что, в свою очередь, способствует конформационным изменениям мем- бран, нарушению их связи с ДНК.

Известно, что биомембраны выполняют целый ряд жизненно необходимых для клетки функций — барьерную, рецепторно-сигнальную, регуляторную, транспортную и др. В этой связи очевидно, что индуцируемая облучением активация процессов ПОЛ в мембранах митохондрий, микросом, лизосом, эндоплазматического ретикулума вызывает нарушения структуры и функции этих образований и клеток в целом.

Таким образом, на биохимическом уровне радиационно-химические процессы приводят к целому ряду структурно-функциональных изменений в субклеточных структурах. Вследствие пе-

 

роксидации ненасыщенных жирных кислот нарушается проницаемость мембран и ионного транспорта, повышается активность мембраносвязанных ферментов, снижается эффективность окислительного фосфорилирования, обеспечиваемого за счет упорядоченной локализации фер- ментов на мембранах митохондрий, увеличивается выход и активация гидролитических фермен- тов вследствие повреждения мембран лизосом. Дисбаланс между активностью нуклеаз и полиме- раз приводит к усилению катаболизма и деградации хроматина, недостаток макроэргов и тор- можение ДНК-полимеразы снижает эффективность пострадиационной репарации, конформаци- онные изменения белково-липидного комплекса способствуют угнетению синтеза ДНК и задерж- ке деления клеток. Все эти нарушения существенно влияют на жизнеспособность облученных клеток и тканей, на течение процессов их повреждения и репарации.

Клеточные эффекты облучения

Ионизирующее излучение способно повреждать практически все внутриклеточные струк- туры, клетки и ткани организма, любой живой объект подвержен губительному воздействию это- го фактора вплоть до гибели. Однако для достижения равнозначного поражающего эффекта раз- личные биологические объекты (как особи различных видов, так и ткани и составляющие их клетки) необходимо подвергнуть облучению в различных, отличающихся в очень широких пре- делах, дозах. Иначе говоря, каждому биологическому виду, виду клеток и тканей свойственна своя мера чувствительности или устойчивости к действию ионизирующих излучений — своя ра- диочувствительность или радиорезистентность. Основным критерием радиочувствительности в радиобиологии и радиационной медицине принято считать зависимость гибели объекта или клеток биосубстрата от поглощенной дозы ионизирующего излучения: чем ниже поглощенная доза, вызывающая летальный эффект, тем выше радиочувствительность объекта.

В 1906 г. французские исследователи И. Бергонье и Л. Трибондо обнаружили, что радио- чувствительность тканей прямо пропорциональна пролиферативной активности и обратно про- порциональна степени дифференцированное™ составляющих ее клеток (правило Бергонье- Трибондо). В соответствии с этим правилом, по степени радиочувствительности ткани организма млекопитающих располагаются следующим образом (от наиболее радиочувствительной до наи- более радиорезистентной): лимфоидная, миелоидная; герминативный, кишечный и покровный эпителий; мышечная, нервная, хрящевая и костная ткани.

В начале XX века была установлена определяющая роль облучения ядра в радиационном поражении клетки, иначе говоря, установлен факт более высокой радиочувствительности клеточ- ного ядра в сравнении с цитоплазмой. Однако лишь спустя полвека было показано, что этот фе- номен обусловлен чрезвычайно высокой радиочувствительностью генетического аппарата клетки и, прежде всего, его основы — ДНК, в молекулах которой сосредоточена практически вся гене- тическая информация клетки.

Облучение вызывает различные радиационно-химические повреждения молекулы ДНК (разрыв двойных связей в пуриновом кольце азотистых оснований, разрыв связей «углевод — ос- нование», «углевод — фосфат» и др.), что, в свою очередь, сопровождается образованием одно- и двунитевых разрывов ДНК, внутри- и межмолекулярных сшивок ДНК — ДНК и ДНК — белок, распадом четвертичной структуры ДНК и ДНК-мембранного комплекса. При одиночных разры- вах (составляющих до 90% пострадиационных повреждений ДНК) связь между отдельными нук- леотидами нарушается в одной из нитей двунитчатой молекулы ДНК, при двойных (10%) — раз- рыв происходит сразу в близрасположенных участках двух нитей, что приводит к распаду моле- кулы полинуклеотида. Любой разрыв сопровождается нарушением считывания информации с молекулы ДНК и пространственной структуры хроматина.

Одиночные разрывы не приводят к поломкам молекулы ДНК, так как разорванная нить прочно удерживается на месте водородными, гидрофобными и другими видами связей с проти- воположной нитью ДНК, кроме того, эти разрывы хорошо репарируются.

Двойные разрывы являются следствием либо одновременного повреждения обеих нитей ДНК, либо (при облучении в высоких дозах) — перехода одиночных разрывов в двойные в связи с повышением вероятности появления близко расположенных разрывов в двух цепях ДНК. При действии на клетку ионизирующих излучений с небольшой плотностью ионизации (гамма- и рентгеновское излучения, быстрые электроны) 20—100 одиночных разрывов вызывают один двойной. Плотноионизирующие излучения (нейтроны, протоны, альфа-частицы) вызывают зна-

 

чительно большее количество двойных разрывов ДНК. Существует линейная зависимость между их числом и дозой облучения. Уже после облучения в дозе 1 Гр в каждой клетке человека может повреждаться около 5000 оснований молекул ДНК, возникает порядка 1000 одиночных и 10-100 двойных разрывов. Около 10% из них не подвергаются репарации и вызывают структурные на- рушения в хромосомном аппарате клетки — так называемые хромосомные аберрации.

Кроме образования разрывов, в облученной ДНК нарушается структура оснований, преж- де всего тимина, образуются сшивки между ДНК и белком нуклеопротеидного комплекса, по- вреждается структура ДНК-мембранного комплекса. Определенное значение в механизмах пост- лучевой гибели клеток придается также структурным нарушениям биомембран (ядерной, мито- хондриальной и др.). В частности, нарушение структур мембран митохондрий сопровождается снижением энергетического обмена, что, в свою очередь, негативно отражается на интенсивности репаративных процессов, для осуществления которых необходимы макроэргические фосфаты.

Происходящие под влиянием облучения структурные изменения элементов клетки (преж- де всего, повреждение ее генетического аппарата) тесно взаимосвязаны с нарушениями ее нор- мальной жизнедеятельности. Наиболее ранними из таких функциональных нарушений является нарушение биосинтеза ДНК, особенно в радиочувствительных тканях (лимфоидные образования, костный мозг, энтероциты) и задержка (угнетение) клеточного деления — так называемый «ра- диационный блок митозов».

Временная задержка первого пострадиационного деления наблюдается лишь после облу- чения в определенном, хотя и достаточно широком диапазоне доз (для большинства клеток мле- копитающих — в пределах 10 Гр). Другая форма задержки деления клеток — полное подавление деления, наблюдается после воздействия высоких доз радиации и в итоге приводит к гибели клет- ки. Однако основной формой постлучевой клеточной гибели, характерной для всех быстропро- лиферирующих тканей, является репродуктивная гибель клеток, т. е. гибель, наступающая не сра- зу после облучения, а в ходе нескольких циклов деления. Основной причиной репродуктивной гибели являются структурные повреждения ДНК, приводящие к хромосомным аберрациям..

Другая форма пострадиационной гибели клеток — интерфазная гибель — наступает до вступления клетки в митоз. Для большинства клеток соматических тканей животных и человека интерфазная гибель регистрируется при облучении в очень высоких дозах, проявляется в виде различных дегенеративных изменений ядра и цитоплазмы и происходит или непосредственно

«под лучом», или в первые часы после облучения. Исключение составляют лимфоциты, для ко- торых интерфазный тип постлучевой гибели является основным и регистрируется уже после об- лучения в дозах 1—2 Гр.

В основе молекулярных механизмов интерфазной гибели клеток лежат повреждения цито- плазматических (ядерных и митохондриальных) мембран, приводящие к нарушению водно- электролитного баланса, высвобождению гидролитических ферментов из лизосом, дес- труктивным изменениям ядра и т. д. Предполагается, что под влиянием облучения в лимфоцитах реализуется генетически детерминированная программа интерфазной гибели по типу апоптоза, инициируемая нарушением структуры ДНК.

2.1.5. Действие ионизирующих излучений на «критические» системы организма Клиническое течение, тяжесть и прогноз лучевого поражения организма определяются, с одной стороны, величиной поглощенной дозы ионизирующего излучения, ее распределением в про- странстве и времени, с другой — радиочувствительностью тканей, органов и систем, наиболее существенных для жизнедеятельности организма. Такие ткани, органы и системы принято назы- вать «критическими», поскольку именно их повреждение определяет преимущественный тип лу- чевых реакций, специфику и время их проявления, а также значимость для выживания или гибели организма в определенные сроки после облучения.

Еще в 40-х годах XX века было показано, что в определенных дозовых диапазонах сред- ние сроки гибели мышей не изменяются, несмотря на увеличение дозы облучения. Так, при облу- чении в дозах до 10 Гр продолжительность жизни животных составляет от нескольких недель до нескольких дней, далее наблюдается плато (несколько дней), несмотря на увеличение дозы от 10 до 100 Гр, а при последующем увеличении дозы облучения продолжительность жизни снова рез- ко укорачивается (от нескольких дней до несколько часов). В последующие годы такой «ступен- чатый» характер зависимости между дозой облучения и средней продолжительностью жизни был

 

продемонстрирован практически для всех видов млекопитающих (мыши, крысы, хомячки, мор- ские свинки, обезьяны, человек), земноводных (лягушки), насекомых, червей и даже растений, что указывает на общебиологический характер этой закономерности. Описанный выше характер кривой «доза-эффект» отражает различные формы лучевого поражения организма, зависящие от степени повреждения той или иной «критической» системы. Так, при облучении человека в дозах до 10 Гр гибель обусловлена повреждением системы кроветворения, (костномозговая форма ОЛБ), 10-80 Гр — поражением желудочно-кишечного тракта (кишечная форма ОЛБ) и, наконец, при облучении в дозах свыше 80 Гр гибель наступает в первые часы после воздействия от нару- шения функции ЦНС (церебральная форма ОЛБ). При облучении в дозе менее 1 Гр проявлений ОЛБ не наблюдается. Возможны умеренные гематологические изменения и нестойкие астенове- гетативные расстройства, которые трактуются как лучевая реакция (табл. 2.1).

 

В самом общем виде патогенез костномозговой формы ОЛБ можно представить следую- щим образом.

Под влиянием облучения в гематопоэтической системе происходят легкие нарушения ди- намического равновесия между отдельными пулами, приводящие в конечном итоге к ее несо- стоятельности, панцитопении и характерным клиническим проявлениям костномозгового син- дрома, описанным ниже. В соответствии с правилом Бергонье и Трибондо наиболее радиочувст- вительными являются клетки стволового пула, а также (хотя и в меньшей степени) элементы де- лящегося — созревающего пула. Практически сразу после облучения отмечается временное пре- кращение деления всех гематопоэтических клеток (блок митозов), независимо от того, какая из них выживет или погибнет в последующем, а также гибель молодых, малодифференцированных и делящихся клеток после одного или нескольких митозов, при минимальных изменениях дина- мики процесса клеточного созревания и времени выхода зрелых элементов в периферическую кровь и продолжительности их пребывания в функциональном пуле. В результате стволовой и делящийся созревающий пулы начинают опустошаться сразу после облучения, число созреваю- щих элементов убывает по мере окончания их дифференцировки и выхода в периферическую кровь, и, наконец, количество зрелых (функционирующих) клеток уменьшается в последнюю очередь, когда их естественная убыль перестает восполняться вследствие опустошения предше- ствующих пулов.

Интенсивность опустошения костного мозга обусловлена скоростью поступления клеток из делящегося созревающего пула в пул созревания, т. е. состоянием (активностью) процессов дифференцировки клеток, а глубина зависит от количества выживших стволовых клеток. Именно в период аплазии кроветворения наблюдаются наиболее драматические события клинического течения лучевого поражения, являющиеся основной причиной летальных исходов, — инфекци- онные осложнения, обусловленные агранулоцитозом, и геморрагические проявления, связанные с тромбоцитопенией. Стадия опустошения сменяется фазой восстановления кроветворной функции костного мозга. Процесс регенерации гемопоэза обеспечивается за счет стволовых клеток, сохра- нивших способность к неограниченному размножению. При этом в первую очередь активизиру- ются реакции, направленные на восстановление пула стволовых элементов и лишь во вторую очередь часть пролиферирующих клеток может быть направлена на репопуляцию следующих компартментов. Процесс регенерации гемопоэза включает несколько системных реакций:

- ускорение темпа размножения оставшихся непораженными или способными к пролифе- рации стволовых клеток;

 

- увеличение скорости созревания коммитированных клеточных элементов;

- вступление в процесс пролиферации стромальных клеточных элементов (прежде всего, фибробластов);

- значительное увеличение в костном мозге количества макрофагов, гистиоцитов и плаз- матических клеток.

Активация пролиферации фибробластов, предшествующая ускорению размножения ство- ловых кроветворных клеток, способствует оптимизации этого процесса, поскольку он осуществ- ляется на основе вновь создаваемой фибробластами подложке. Изменения, происходящие в сис- теме плазматических и макрофагальных элементов костного мозга, способствуют удалению из него продуктов распада кроветворных клеток и также облегчают регенерацию гемопоэза.

При кишечной форме ОЛБ гибель организма обусловлена несостоятельностью функций клеток кишечного эпителия. При этом наиболее радиочувствительными являются стволовые клетки крипт тонкого кишечника, большая их часть погибает уже при облучении в дозах 4—6 Гр. Зрелые эпителиоциты кишечных ворсинок являются значительно более радиорезистентными, ос- новная их часть (так же как клетки функционального пула кроветворной ткани) погибает после облучения в дозах свыше 15 Гр. Большая (по сравнению с родоначальными элементами гемопо- этической системы) радиоустойчивость стволовых клеток кишечника связана с тем, что в послед- них процессы постлучевой репарации и регенерации протекают значительно быстрее, чем в кост- ном мозге. Клинические проявления кишечного синдрома могут отмечаться уже при тяжелой и крайне тяжелой степени костномозговой острой лучевой болезни (доза облучения 6—10 Гр), од- нако дозовый порог полного опустошения стволового пула крипт, обусловливающего декомпен- сацию функции кишечника при лучевом поражении, составляет для человека 10—20 Гр («кишеч- ная форма ОЛБ»).

Кинетические параметры развития кишечного синдрома определяются временем прохож- дения энтероцита по поверхности ворсинки от ее основания к вершине с последующим слущива- нием. Сразу после облучения в «кишечном» диапазоне доз значительная часть стволовых клеток крипт погибает по интерфазному механизму, другие (по окончании фазы митотического блока) погибают после одного или нескольких делений. В результате опустошения выстланных зароды- шевым эпителием крипт прерывается процесс новообразования и поступления на ворсинку эпи- телиоцитов и (поскольку продвижение зрелых клеток по ворсинке и их слущивание продолжает- ся с нормальной скоростью) происходит полное оголение ворсинки и слизистой оболочки ки- шечника, приводящие, в свою очередь, к нарушению его основных функций — барьерной и под- держания водно-электролитного баланса организма.

Обезвоживание организма при кишечном синдроме обусловлено нарушением процессов активного всасывания и реабсорбции воды и электролитов, возрастанием экскреции жидкости в просвет кишечника и усилением его моторно-эвакуаторной функции, что в конечном итоге при- водит к развитию тяжелой диареи.

Нарушение целостности кишечного барьера (оголения слизистой кишечника и опустоше- ние пейеровых бляшек) способствует развитию бактериемии и генерализации инфекции. Кроме того, выделяемые кишечными бактериями токсины увеличивают гибель эпителиоцитов и уско- ряют процесс оголения ворсинок.

Помимо гибели клеток покровного эпителия кишечника, важнейшую роль в механизмах развития инфекционных проявлений кишечного синдрома играет поражение гемопоэза, способ- ствующее снижению противоинфекционной резистентности организма.

Сосудисто-токсическая форма ОЛБ, развивающаяся после облучения в диапазоне 20-80 Гр, проявляется в виде тяжелых гемодинамических расстройств, обусловленных парезом и по- вышением проницаемости сосудов, и симптомами общей интоксикации, вызванной про- никновением во внутреннюю среду организма продуктов радиационного распада тканей, первич- ных и вторичных радиотоксинов, эндотоксинов кишечной микрофлоры.

Важную роль в механизмах развития этой формы лучевого поражения играет массивный выброс в кровоток биологически активных веществ (катехоламины, серотонин, гистамин, кишеч- ные пептиды) из эндокринных клеток, локализованных, главным образом, в энтерохромаффин- ных клетках кишечника; компонентов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (вазокрин- ные пептиды, минералокотикоиды), калликреина, простагландинов и др.

 

Перечисленные сдвиги приводят к повреждению синаптических образований в структурах головного мозга, нарушению функций основных нейромедиаторных систем (дофамин-, серото- нин-, ГАМК, холинэргических), дисбалансу в системе циклических нуклеотидов, что в свою оче- редь сопровождается изменениями метаболизма в самих нервных клетках, нарушениями регуля- ции биохимических и физиологических процессов в облученном головном мозге, расстройствами микроциркуляции, повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера, развитием ост- рой гипоксии, отека и набухания головного мозга, нарушениями гемодинамики и дыхания и, в конечном итоге, приводят к гибели организма в течение 4-7 сут после облучения.

Церебральная форма ОЛБ, при которой нарушения структуры и функции ЦНС являются критическими для течения и исхода радиационного поражения организма, развивается у млеко- питающих, в том числе и у человека, после облучения в дозах свыше 80 Гр и только в том случае, если воздействию ионизирующих излучений подвергается непосредственно головной мозг. Неко- торые проявления церебрального лучевого синдрома (ЦЛС), в частности так называемая «ранняя преходящая недееспособность» (РПН), могут возникать и при облучении в дозах порядка 30-50 Гр.

Одним из пусковых механизмов развития церебрального лучевого синдрома (прежде всего его наиболее ранней фазы — РПН) является деэнергизация нейронов, обусловленная угнетением процессов окислительного фосфорилирования и продукции макроэргов. Нарушения Функций нервных центров при церебральной форме ОЛБ связаны также с расстройством гемо- и ликворо- динамики в головном мозге, повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера, оте- ком и набуханием нервных клеток. Смерть пострадавших обычно наступает в течение 1—2 сут после облучения от паралича дыхательного центра.