Вопрос №49 « первично-трипсинизированные культуры клеток. Их достоинсва и недостатки. Применение в вирусологических исследованиях».

ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. С помощью метода КК были решены некоторые теоретические вопросы – о взаимодействии вируса с клеткой, месте репродукции вирусов, механизме антивирусной иммунизации. В настоящее время КК применяют для выделения вирусов из патматериала, их индикации, идентификации, для постановки реакции нейтрализации, определения титра вирусов, для приготовления диагностических АГ и вакцин, в качестве тест – объектов в реакции нейтрализации.

 

ВОПРОС №50 «ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РАСТВОРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ВИРУСОВЛОГИИ. ТРЕБОВАНИЯ К ПОСУДЕ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КК, ЕЕ ОБРАБОТКА».

Наиболее широко используют при работе с КК растворы Хенкса и Эрла, которые готовят на бидистиллированной воде с добавлением различных солей и глюкозы. Эти сбалансированные солевые растворы используют для приготовления всех питательных сред, т.к. они обеспечивают сохранение рН, осмотическое давление в клетках и соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Их же применяют для отмывания от ростовых сред, разведений вируса и другого. При культивировании клеток применяют диспергирующие растворы трипсина и версена. Раствор трипсина используют для разделения кусочков тканей на отдельные клетки и для снятия слоя клеток со стекла. Раствор версена – используют для снятия клеток со стекла. Питательные среды (далее ПС) – различают: 1)естественные среды, которые состоят из смеси солевого раствора, сыворотки крови, тканевого экстракта, коровьей амниотической жидкости и др. Количество компонентов варьирует. Используют их редко. 2)искусственные ПС – ферментативные гидролизаты различных белковых продуктов: гидролизат лактальбумина, мышечный ферментативный гидролизат и др. Из синтетических сред наиболее широкое применение нашли среда 199 и среда Игла. Во все питательные среды и некоторые солевые растворы добавляют индикатор феноловый красный для определения концентрации водородных ионов. Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют АБ: пенициллин и стрептомицин по 100ЕД\мл. Все ПС делят на 2 группы: ростовые – обеспечивают жизнь и размножение клеток; поддерживающие – обеспечивающие жизнедеятельность клеток, но не их размножение (они не содержат сыворотки крови). Посуда – качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. Она д\б стерильной, обезжиренной, не обладать токсическим действием. Для культивирования клеток используют пробирки, матрасы на 50, 100, 250, 500, 1000, 1500 мл, роллерные колбы на 500, 1000, 2000 мл, различные пипетки, флаконы для ПС и растворов, колбы различной вместимости. Обработка стеклянной посуды состоит из нескольких этапов: 1)инфицированную посуду погружают в 2-3% раствор NaOH на 5-6 часов; 2) споласкивают в 3-4 сменах водопроводной воды; 3) замачивают в 0,3-0,5% растворе порошка; 4) тщательно моют с помощью ерша в теплом растворе порошка; 5) споласкивают в нескольких сменах водопроводной воды; 6)споласкивают в дистиллированной воде, содержащей 0,5% HCl; 7)споласкивают 4-5 раз водопроводной водой и в 3 сменах дистиллированной воды; 8) сушат в сушильном шкафу; 9)монтируют и стерилизуют в сушильном шкафу или автоклавируют.