Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Оценка клеточной цитотоксичности
Классический феномен цитотоксичности - способность Т-лимфоцитов распознавать клеточные элементы, несущие признаки генетической чужеродности (в частности, клетки, модифицированные вирусом, опухолевые клетки, аллогенные и ксеногенные клетки), и уничтожать их. NK-клетки, в отличие от Т-лимфоцитов, распознают как чужеродные клетки организма, утратившие антигены главного комплекса гистосовместимости (молекулы МНС). Другие клетки (например, В-лимфоциты, моноцитарно-макрофагальные клетки, эозинофилы, нейтрофилы и т.п.) также способны к цитотоксичности, но эта функция связана с привлечением антител против клеткимишени - КМ (антителозависимая клеточная цитотоксичность), цитокинов (ФНОа) и иных агентов. В физиологических условиях, т.е. в норме, цитотоксичность клеток иммунной системы направлена на разрушение и элиминацию стареющих и поврежденных клеток, таким образом обеспечивая клиренс многоклеточного организма от отживших клеток и продуктов их распада. Основные клетки, обладающие цитотоксичностью, - антигенспецифические цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), NK (естественные киллеры), а также клетки миелоидного ряда (макрофаги, нейтрофилы). Цитотоксическая активность клеток-киллеров реализуется при непосредственном синаптическом контакте лимфоцита (клеткиэффектора - КЭ) с КМ. При этом в КМ индуцируется апоптоз. В зрелом дифференцированном цитотоксическом лимфоците формируются гранулы, содержащие перфорин и гранзимы. После образования синапса между КЭ и КМ гранулы концентрируются в области контакта и затем освобождаются в направлении КМ. Перфорин при контакте с мембраной КМ полимеризуется и встраивается в мембрану, формируя в ней пору диаметром около 100 Ǻ. В эту пору проникают гранзимы - ферменты, инициирующие апоптоз КМ. Индукция апоптоза в КМ также может происходить через CD95 молекулы (другое название Fas), содержащие домен смерти. Лигандом CD95 служит молекула FasL (CD178), экспрессируемая на ЦТЛ, NK-клетках. В некоторых случаях КЭ сами становятся «жертвой» Fas-опосредованного апоптоза. Экспрессируя Fas-молекулы, они могут проконтактировать с клетками, несущими Fas-лиганд, например, при потытке преодолеть гематоэнцефалический барьер. Повышенная экспрессия Fas (CD95) молекул на активированных лимфоцитах демонстрирует их способность к апоптозу при несостоявшихся физиологических процессах пролиферации и дифференцировки после активации. Считается, что такой процесс может привести к феномену, обозначенному как иммунодефицит, вызванный активацией (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н.).
В системе in vitro степень разрушения КМ приближается к лизису. Методов оценки функциональной активности ЦТЛ существует несколько, однако «золотым стандартом» до сих пор считается «хромовый тест». Под «хромом» имеют в виду соль хромата натрия, содержащую радиоактивный изотоп хрома - Na251CrO4, которую используют для мечения КМ. Такую метку подобрали опытным путем как относительно удовлетворяющую следующим критериям: свободно проникать в живые клетки и не выходить оттуда, пока клетка жива. Метка не вступает в прочные соединения с внутриклеточными структурами и имеет возможность выйти во внеклеточную среду из погибающей КМ. Выбор КМ - отдельная творческая задача, которую экспериментально решают в соответствии с целями конкретного исследования. Чаще всего в качестве КМ используют опухолевые или зараженные вирусом клетки. Когда КМ выбраны, дальнейшая схема эксперимента кратко представляет собой следующее. Лабораторная работа 3-1 1. 1х106 КМ инкубируют в среде, содержащей изотоп Na251CrO4 (37×105 Bq или 100 мкКю, специфическая активность 5 мкКю/моль), при 37 °С в течение 1-1,5 ч, после чего тщательно отмывают от не вошедшего в клетки изотопа. 2. КМ подсчитывают и раскапывают в подобранной дозе в лунки культуральных круглодонных микропланшетов. 3. В те же лунки вносят КЭ. Соотношение КМ и КЭ обычно составляет от 1:10 до 1:500 в пользу КЭ. 4. Плашки подвергают мягкому центрифугированию - 150 g в течение 1 мин, после чего помещают в СО2-инкубатор при 37 °С на 4-6 ч. 5. По завершении культивирования плашки центрифугируют при 250 g в течение 5 мин для плотного осаждения клеток. 6. Супернатанты собирают в специальные пробирки, в которых радиоактивность подсчитывают в γ-счетчике. 7. В качестве контроля используют: а) лунки с КМ, в которые не вносят КЭ, - это контроль спонтанного выхода метки; б) лунки с КМ, в которые вместо КЭ вносят детергент Triton X-100 1% (v/v), - это контроль максимально возможного высвобождения метки из КМ. Цитотоксичность в опытных лунках рассчитывают обычно по следующей формуле: где CPM - это число импульсов в минуту соответственно в экспериментальных лунках (СРМn), в лунках со спонтанным высвобождением метки (СРМспонтанно) и в лунках с максимально возможным высвобождением метки (CPMmax).
|
|||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-02-10; просмотров: 208; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.140.198.173 (0.005 с.) |