Секвенирование днк по методу сэнгера

Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК.

Этот метод также основан на ПЦР. Основные отличия заключаются в том, что а) при секвенировании по Сэнгеру в одной реакции используется один праймер и б) используются дидезоксинуклеотиды.

Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся матрица, ДНК-полимераза, необходимый солевой буфер, четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотиды статистически включаются по каждой позиции в смеси растущих цепей. После каждого такого включения рост цепи сразу останавливается, так как дидезоксинуклеотиды не имеют 3'-OH группы, необходимой для наращивания цепи.

В результате в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность и заканчивающихся соответствующим дидезоксинуклеотидом. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводятэлектрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках и проводят радиоавтографию.

Поскольку известны длины всех фрагментов и нуклеотид, на который они заканчиваются, можно восстановить исходную нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

В настоящее время все четыре дидезоксинуклеотида метят четырьмя разными флюоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время капиллярного электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определённом месте геля возбуждает флюоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Для секвенирования по Сэнгеру применяют также специальные модифицированные ДНК-полимеразы, способные включать в цепь меченые громоздкими флюоресцентными группами дидезоксинуклеотиды.

 

 

Рис. 20. Общая схема метода секвенирования ДНК по методу Сэнгера. Исследуемая матрица амплифицируется отдельно в присутствии каждого из дидезоксинуклеотидтрифосфатов. В каждой пробирке образуется уникальный набор продуктов. Далее эти продукты разделяются электрофорезом с разрешением до одного нуклеотида. По длине фрагментов, образовавшихся в каждой пробирке, восстанавливают последовательность матрицы.

 

Микрочипы

Одна из самых широко применяемых технологий, основанная на принципе гибридизации нуклеиновых кислот — использование ДНК-микрочипов.

ДНК-микрочип (микроэррей) представляет из себя набор микроскопических фрагментов ДНК (зондов), иммобилизованных, как правило, ковалентно на твердой подложке. Это могут быть короткие участки ДНК как генов, так и любых других последовательностей ДНК, способные специфично гибридизоваться с исследуемой кДНК (мишенью). Степень гибридизации зонда с мишенью обычно оценивают по уровню флюоро- или хемилюминисценции метки, присоединенной к мишени.

Сушествует два основных типа микрочипов: точечные микрочипы, получаемые нанесением фрагментов ДНК на покрытое гелем предметное стекло микроскопа, и олигонуклеотидные микрочипы высокой плотности, которые производят путем прямого синтеза олигонуклеотидов на стеклянной подложке.

Поскольку на одном микрочипе обычно помещаются десятки тысяч зондов, можно одновременно оценивать экспрессию очень большого числа генов, что упрощает анализ.ДНК-микрочипы применяются для одновременного измерения уровня экспрессии большого числа генов, генотипирования, количественных оценок, детектирования ОНП, альтернативного сплайсинга и т.д.

Предположим, перед нами стоит задача сравнить экспрессию генов в печени у здорового человека и больного. Для этого обычно применяют двухцветные (или двухканальные) микрочипы.

Сначала необходимо выделить тотальную мРНК из печени здорового и больного. Затем по матрице этой РНК при помощи обратной транскриптазы получить кДНК, меченую флюорофорной меткой. Для это используют меченые аналоги нуклеозидтрифосфатов. Флюоресцентные краски, которые обычно применяют для мечения кДНК, имеют длину волны эмиссии флюоресценции в областях спектра, соответствующих красному или зеленому. Пометим кДНК, полученную от больного человека, например, красным флюорофором, а от здорового — зеленым.

Полученную суммарную кДНК можно использовать в ПЦР со специфичными праймерами для получения целевого продукта, для получения библиотеки, клонирования-секвенирования и получения базы данных экспрессирующихся последовательностей – EST (expressed sequence tags), а также для исследования уровня экспрессии тех или иных генов. кДНК используется для техники микроэрреев или биочипов. Сравнение экспрессии генов в разных тканях (здоровых и раковых; на разных стадиях развития; и т.д.) позволяет выявлять различия в экспрессии тех или иных генов, проследить изменения профиля экспрессии генов на разных стадиях развития, выявить возможные мишени для дальнейшей разработки лекарств.

Полученная смесь молекул кДНК отражает содержание транскриптов в исходной смеси мРНК: чем больше данной мРНК было в исходной смеси, тем больше ее кДНК-копий. На следующем этапе кДНК из двух образцов смешивают и гибридизуют с одним и тем же микрочипом. При этом индивидуальные олигонуклеотиды, закрепленные на подложке взаимодействуют со своими мишенями, находящимися в образце. После окончания процесса гибридизации чипы промываются для удаления остатков материала.

В каждой ячейке микрочипа содержится примерно 10⁶-10⁷ копий фрагмента, что намного превышает число копий каждой специфической кДНК в исследуемом образце. В таких условиях происходит ненасыщающая гибридизация. Интенсивность сигнала в каждой ячейке пропорциональна содержанию данного типа кДНК. Микрочип сканируют на двух длинах волн эмиссии флюоресценции, соответствующих излучению каждого красителя. Затем с помощью компьютера результаты накладываются друг на друга и выводятся на экран в виде изображения микрочипа с окрашенными в разные цвета ячейками. Поскольку красным флюорофором мы метили кДНК больного человека, а зеленым — здорового, ячейки, которые окрашены только красным, соответсвуют РНК, присутствовавшей только у больного человека, те, которые окрашены только зеленым — только у здорового. В ячейках, где происходит наложение цветов (в нашем случае они будут желтого цвета), находятся зонды, соответствующие генам, которые экспрессируются и у здорового, и у больного человека. Темными остаются ячейки, с которыми не гибридизовалась никакая кДНК из исследуемых образцов.

Можно проводить подобный анализ и на одноканальном микрочипе. Тогда оба набора кДНК метятся одним и тем же флюорофором, но гибридизуются с двумя копиями микрочипа отдельно. Плюс одноканального подхода в том, что каждый чип взаимодействует только с одним образцом. Это значит, что один плохо подготовленный образец не сможет повлиять на качество данных, полученных по другим образцам. Другой плюс одноканальной системы состоит в том, что данные, полученные с ее помощью в разных экспериментах, проще сравнивать между собой.

 

Рис. ДНК-микрочип. Сравнительный анализ уровней генной экспрессии. Сначала при помощи обратной транскрипции получают меченную флюорофорами кДНК. кДНК гибридизуют с микрочипом и отмывают от несвязавшихся молекул. Затем снимают флюоресценцию на соответсвующих длинах волн и обрабатывают полученные данные на компьютере. Объединенное изображение демонстрирует четыре типа сигналов: W - гены, экспрессирющиеся одинаково в двух образцах мРНК, X - гены, экспрессирующиеся сильнее в образце 1, Y - гены, экспрессирующиеся сильнее в образце 2, Z – гены, неэкспрессирующиеся ни в одном из образцов.

Часть 2. Задачи

1. Перед вами два примера мембранных липидов. Один характерен для бактерий и эукариот, другой – для архебактерий. Установите соответствие.

 

2. Что получится при электрофорезе смеси фрагментов ДНК: (T)₁₅₀, (G≡C)₁₅₀ и (T=A)₁₅₀?

3. Будет ли этот фрагмент ДНК разрезаться рестриктазами EcoRI (5’-GAATCC), AluI (5’-AGCT), PstI (5’-CTGCAG)? Если да, то сколько фрагментов получится?