Технология рекомбинантных ДНК

Технология рекомбинантных ДНК стала возможной в результате выделения и биохимической характеристики ферментов, которые бактерии используют для манипуляций с ДНК в процессе своей нормальной жизнедеятельности. Скоро стало ясно, что если эти ферменты выделить в чистом виде, то их можно использовать для создания новых комбинаций различных фрагментов ДНК in vitro. Такие новые фрагменты назвали рекомбинатными молекулами ДНК.

Для создания рекомбинантных молекул ДНК необходимы рестриктазы и лигазы. ДНК-лигазы - это ферменты, которые соединяют ковалентно (лигируют) фрагменты ДНК. Некоторые из них могут соединять тупые концы, а другие — только липкие. Совместимость перекрывающихся фрагментов зависит от используемых эндонук-леаз рестрикции.

Рис. 5.

Многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают молекулу ДНК несиммет­рично, в результате чего образуются взаимно комплементарные одноцепо-чечные концы («липкие концы»). Любые два сегмента ДНК, имеющие такие концы, могут рекомбинировать in vitro. Если один из сегментов способен реплицироваться в соответствующей клетке-хозяине, то вся рекомбинантная молекула может быть клонирована и амплифицирована. В приведенном примере плазмидные ДНК соединены с двумя фрагментами, полученными с помощью рестриктирующих эндонуклеаз (верхняя часть рисунка).

 

Для экспериментов с определенной последовательностью ДНК необходимо получить достаточное количество ее копий. Первым существенным достижением в области технологии рекомбинантных ДНК стал метод получения миллионов копий с одной и той же последовательности ДНК — метод, известный как молекулярное клонирование.

Исследователи уже давно знали о существовании в бактериях генетических элементов — плазмид и бактериофагов (фагов), способных к автономной репликации с образованием большого числа копий (автономные репликоны). Технология рекомбинантных ДНК дала возможность присоединять такие репликоны к последовательностям ДНК человека, которые таким образом можно было амплифицировать. Это привело к созданию на основе ДНК плазмид и фагов так называемых клонирующих векторов (то есть, переносчиков чужеродной ДНК), которые были предназначены для клонирования фрагментов чужеродной ДНК. Общая схема метода м Общая схема метода молекулярного клонирования показана на рис.6.

Рис. 6. Принципиальная схема молекулярного клонирования в клетках с использованием плазмидных векторов. Вектор расщепляют эндонуклеазой рестрикции по уникальному сайту узнавания. ДНК-вставку, полученную с использованием той же рестриктазы, соединяют с вектором с помощью ДНК-лигазы. Затем вектор, содержащий вставку, вводится в клетки бактерии Escherichia coli методом трансформации. Вектор содержит селектируемый маркерный ген, обеспечивающий выживание и размножение в присутствии антибиотика только трансформированных, а не нормальных бактерий. При высевании бактерий на чашку Петри со средой трансформанты образуют колонии, содержащие около 1 * 10⁶ клеток, причем каждая клетка содержит несколько сотен копий плазмиды. Индивидуальные колонии отбирают и выращивают в больших объемах культуральной среды в селектирующих условиях для дальнейшего выделения больших количеств ДНК. Амплифицированная в составе вектора ДНК-вставка может быть теперь вырезана с помощью того же фермента рестрикции, который был использован при встраивания ее в вектор.

Для молекулярного клонирования, как правило, используют не любые молекулы ДНК, способные к автономной репликации, но специально адаптированные вырусы и плазмиды. Такие векторы кроме ориджина репликации содержат специальные репортерные гены, позволяющие отслеживать наличие вектора в клетке, и множественные сайты рестрикции.

 

Репортерные гены.

Гены флюоресцентных белков. Продукт некоторых репортерных генов можно непосредственно наблюдать в клетках и по его наличию судить о присутствии в клетке рекомбинатного вектора. Такими репортерными генами могут быть гены флюоресцентных белков, излучающих свет при облучении ультрафиолетом.

Гены устойчивости к антибиотикам. Во многих плазмидах, обнаруженных в природе, закодированы гены, позволяющие бактериям противостоять воздействию различных антибиотиков. Это свойство можно использовать для селекции трансформированных клонов.

С помощью генов устойчивости к антибиотикам можно отобрать не только клоны, несущие вектор, но именно те колонии, которые содержат вектор со встройкой. Это очень полезный метод, так как эффективность лигирования вектора со встройкой не всегда стопроцентная, и часть клеток может получить плазмиду, которая зашилась сама на себя и не несет встройки. Для этого в векторе должно содежаться два гена устойчивости к разным антибиотикам, например к ампициллину и хлорамфениколу. Обычно такие гены обозначают Amp^re и Chlo^re. В одном из этих генов должен находиться сайт рестрикции, по которому происходит встройка целевого фрагмента. Сначала бактерии необходимо высеять на среде, содержащей ампициллин. Выжить на ней смогут только те колонии, которые содержат вектор с геном Amp^re. Затем, при помощи бархатной печатки отпечаток колоний переносят на среду с хлорамфениколом. Поскольку в плазмидах, несущих целевую встройку, ген Chlo^re нарушен, на этой среде они расти не смогут. Таким образом можно определить, какие колонии несут вектор со встройкой.

Также часто пользуются удобной репортерной системой X-gal/LacZ (в частности, она реализована в популярной плазмиде pBluescript). В таких векторах присутствует ген LacZ, кодирующий фермент β-галактозидазу. Этот фермент взаимодействует с бесцветным полисахаридом X-gal с образованием продукта, окрашенного в ярко-синий цвет. Cайт для внедрения встройки располагают в гене LacZ. Следовательно, те колонии, которые при выращивании на среде, содержащей X-gal, окажутся неокрашеными, несут встройку, поскольку встройка сбивает рамку считывания гена β-галактозидазы. Однако, следует помнить, что длина встройки в парах нуклеотидов не должна быть кратна трем.

Также наличие целевой встройки можно оценить при помощи ПЦР. Для этого необходимо иметь праймеры, располагающиеся по краям встройки. Плазмидную ДНК для анализа можно получить все лишь прикоснувшись носиком пипетки к колонии. Размер ПЦР-продуктов на электрофорезе говорит о длине встройки.

Рис. 7. Стандартный плазмидный вектор

Рис. 8. Типичный вектор, сконструированный на основе фага М13. Цифрами отмечены разные гены фага (гены 2 и 5 ответственны за репликацию, остальные детерминируют образование капсида и сборку). Светлый овал - область начала репликации; некодирующий участок выделен цветом. В некодирующую область фагового генома встроена часть lас -оперона E. coli. Затем в ген lac Z встроен сегмент длиной 42 п.н., содержащий несколько сайтов для эндонуклеаз рестрикции (полилинкер, или мультиклонирующий сайт).

Прежде чем клонировать специфическую генную последовательность, ее необходимо выделить из природных источников. ДНК может быть выделена из различного материала: свежего, замороженного, сушенного, фиксированного и т.д. В каждом случае подбирается соответствующий метод. Методы выделения ДНК могут значительно отличатся деталями, однако любой из них включает три стадии: 1. Гомогенизация 2. Обработка детергентом (лизис клеточных мембран) 3. Очистка ДНК.

Таким образом происходит выделение тотальной ДНК, то есть, интересующие исследователя индивидуальные последовательности ДНК (например, индивидуальные гены) «разбавлены» миллионами не относящихся к ним фрагментов ДНК.

Одним из подходов к решению этой проблемы является первоначально тотальное клонирование всех выделенных фрагментов генома – создание библиотеки ДНК. Затем проводится скрининг библиотеки (то есть, поиск в ней колоний, соответствующих интереующим участкам генома).

Такой скрининг можно осуществлять путем гибридизации с использованием меченого ДНК-зонда. Этот метод выявления нужного клона в библиотеке основан на способности зонда узнавать определенную комплементарную последовательность. Подходящие зонды или праймеры могут быть выбраны на основании данных о структуре частичных клонов данного гена, родственных генов из других организмов, консенсусных последовательностей, характерных для определенного семейства генов, или аминокислотных последовательностей белков.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод амплификации (умножения числа копий) фрагментов нуклеиновых кислот in vitro, с помощью которого можно быстро и избирательно получить миллионы копий определенных (целевых) нуклеотидных последовательностей.

В ПЦР для амплификации фрагментов ДНК используют термоустойчивую ДНК-полимеразу из термофильной бактарии Thermus aquaticus (Taq-полимераза), которая в присутствии четырех видов дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дАТФ, дГТФ, дСТФ, дТТФ) и коротких 20-30членных затравок (праймеров) осуществляет синтез комплементарных последовательностей ДНК. В качестве матрицы для ПЦР можно использовать тотальную ДНК, полученную из исследуемого материала.

В ходе ПЦР проводят термическую денатурацию двуцепочечной молекулы ДНК про 93-95 °С, после чего пробы охлаждают примерно до 60 °С, хотя оптимальная температура отжига (т. е. возникновения комплементарных взаимодействий между праймером и матрицей) различных праймеров отличается), что дает возможность праймерам связаться с одноцепочечной (в результате денатурации) ДНК. Праймеры подстраиваются по комплементарному принципу к гомологичным участкам «материнской» ДНК и служат для двух целей: запускают работу Taq-полимеразы и одновременно ограничивают участок синтеза ДНК. ПЦР имеет циклический характер. В первом и частично во втором цикле образуются копии (ампликоны), не соответствующие границам амплифицируемого гена. Начиная с третьего цикла длина большинства ампликонов становится стандартной, т.е. соответствует числу пар нуклеотидов ДНК-матрицы между 3’ концами праймеров. Ампликоны накапливаются в геометрической прогрессии, так как синтезированные ампликоны в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Повторяя циклы амплификации 30-40 раз, можно за 1,5-3 ч получить миллионы копий гена (2n, где n – число циклов амплификации).

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

· Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.

· Термостабильная ДНК-

· Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

· Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин

Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Рис. 9. Принцип полимеразной цепной реакции. Двухцепочечную ДНК-матрицу денатурируют (разделяют на отдельные цепи), и проводят отжиг с двумя праймерами. Праймеры присоединяются к противоположным цепям навстречу друг другу, определяя границы целевого амплифицируемого фрагмента. В процессе достройки праймеров происходит копирование участка ДНК, расположенного между двумя праймерами, и в результате количество матрицы удваивается. Цикл реакций денатурации матрицы, отжига и удлинения праймеров повторяется 25—30 раз. При избытке праймеров и других компонентов реакции после 25 циклов теоретически может получиться более 8 млн копий фрагмента.

 

 

ПЦР — очень быстрый, чувствительный и производительный метод. Его можно использовать для получения больших количеств специфических фрагментов ДНК, исходя из очень малых количеств исходного материала, причем не обязательно хорошо сохранившегося. Однако копирование с помощью ПЦР в целом менее точное, чем клонирование в клетках, потому что ДНК-полимеразы, используемые в этой процедуре, имеют склонность к ошибкам. Стандартный метод ПЦР пригоден для амплификации фрагментов длиной только до 5 тыс. п. н., в то время как специальные векторы для клонирования позволяют умножать фрагменты ДНК длиной несколько сотен тыс. п. н.