Изготовление гистологических препаратов

1). Для предотвращения посмертных изменений исследуемой ткани взятый материал сразу подвергают фиксации. При этом происходит коагуляция белков и др. реакции. Способ фиксации зависит от особенностей объекта и задач исследования. В фиксированном состоянии ткани могут храниться достаточно долго.

2). Для изготовления препарата проба ткани подвергается предварительной промывке в проточной воде.

3). Для удаления из объекта воды его последовательно выдерживают в водном растворе этилового спирта возрастающих концентраций (50, 60, 70, 80, 90, 100%).

4). Для заливки кусочки тканей предварительно пропитывают жидкостями, которые служат растворителями парафина (ксилол, хлороформ) или целлоидина (равная смесь 100% этилового спирта с эфиром). Продолжительность заливки в парафин меньше и позволяет делать более тонкие срезы, чем заливка в целлоидин. Однако последняя позволяет получать срезы самых плотных тканей (сухожилий, связок, хрящей, кости и т. п.).

5). Гистологические срезы изготовляют с помощью микротома. (Толщина криостатных и целлоидиновых срезов несколько больше, нежели парафиновых). Полученные срезы наклеивают на предметное стекло.

6). Для окраски срезов парафин (целлоидин) устраняют соответствующими растворителями и возвращают воду посредством проводки через последовательность этилового спирта последовательно понижающейся концентрации (100-50%).

7). Применяемые в гистологии красители и методики окраски весьма разнообразны. Их выбор обуславливается особенностями объекта и задачами исследования.

8). Для долговременного хранения срезы заключают в плотную прозрачную среду, чей коэффициент преломления света близок стеклу (обычно в пихтовый или канадский бальзам посредством его раствора в ксилоле), после чего накрывают покровным стеклом.

Работа с гистологическими препаратами

Исследование гистологического препарата имеет ряд особенностей, которые всегда надо иметь виду.

1). Прежде всего, то, что препарат представляет собой не целостный объект исследования, а срез, фрагмент, проекцию этого объекта на плоскость. И поскольку форма этого среза обусловлена той плоскостью, в которой ткань разрезал нож микротома, то срезы внешне выглядят весьма разнообразно, хотя и изготовлены с одного и того же объекта. Поэтому для получения верного результата морфологических наблюдений необходимо осмыслить, синтезировать информацию, полученную с помощью разных срезов.

2). Хотя тканевые структуры в целом менее вариабельны, чем биологические структуры более высоких уровней организации, тем не менее, вариабельность выражена и здесь, и потому, так же как и в любых других исследованиях, интерес представляют, прежде всего, данные усреднённые, наиболее характерные для той или иной ткани. Поэтому для получения верных выводов необходимо исследовать серию срезов, препаратов.

3). Поскольку «набор» признаков тех или иных тканевых структур невелик (это прежде всего клетки), то значимыми являются все их особенности – форма, размеры, взаиморасположение и число компонентов ткани и др.

4). В ряде случаев важными также являются особенности окраски тех или иных структур (например, зернистые лейкоциты крови различаются прежде всего по окраске).

 

 

Порядок работы с препаратом

Прежде чем приступить к непосредственной работе с препаратом, прежде всего нужно убедиться в исправности микроскопа, наличии окуляра и объективов, обеспечивающих необходимы увеличения. При подготовке микроскопа к работе необходимо обеспечить качественное освещение, протереть мягкой тканью оптику и препарат.

Для исследования препарат следует помещать на предметный столик всегда покровным стеклом вверх. Рекомендуется прижимать его клеммами, особенно при работе с иммерсией, так как в этом случае препарат нередко прилипает к объективу, что затрудняет работу с ним.

Исследование препарата следует начинать с объективом меньшего увеличения; с его помощью привести изображение выбранного участка объекта в центр видимого поля зрения микроскопа, затем, при необходимости, перейти к объективам большего увеличения. При этом следует иметь в виду, что при возрастании кратности увеличения кратно уменьшается освещённость.

При работе с иммерсией, пользуясь неиммерсионными объективами, возможно точнее установить интересующий участок препарата в центр видимого поля микроскопа, после чего на покровное стекло нанести каплю иммерсионного вещества. Ввести в ход лучей иммерсионный объектив. Наблюдая сбоку за просветом между объективом и препаратом, вращением рукоятки грубой фокусировки очень осторожно опустить тубус до соприкосновения объектива с каплей иммерсии и появления исследуемого объекта в поле зрения. С помощью тонкой фокусировки добиться чёткого изображения. (В слое иммерсии не должно быть пузырьков воздуха; в противном случае следует поднять объектив до разрыва с каплей и вновь настроить микроскоп).

Перемещать препарат на предметном столике нужно легкими плавными движениями; при наличии у столика центрировочных винтов и препаратоводителя пользоваться ими.

По окончании работы снять с объектива и препарата иммерсионное масло мягкой тканью, смоченной бензином.

В случае всех затруднений обращаться за помощью к преподавателю.

 

Номера препаратов приведены в соответствии с таковыми в стандартных наборах, выдаваемых на практичксих занятиях. Иллюстрирующие их рисунки приведены в «Приложении».