Значение рН, при котором электрофоретическая подвижность белка равна нулю, называется изоэлектрической точкой.

В кислой среде, когда в результате избытка водородных ионов подавлена ионизация карбоксильных групп, молекула белка ведет себя как основание, приобретает положительный заряд и при электрофорезе движется к катоду. В щелочной среде, наоборот, подавлена ионизация аминогрупп, и молекула белка ведет себя как кислота и при электрофорезе передвигается к аноду. В изоэлектрическом состоянии свойства растворов белков резко меняется: при этом они имеют, наименьшую вязкость, плохую растворимость. При значении рН, близком к изоэлектрической точки, разноименно заряженное группы -NH₃⁺ и COO^- притягиваются друг к другу и нить закручивается в спираль. Молекулы ВМС в развернутом состоянии придают растворам более высокую вязкость, чем молекулы ВМС, свернутые в спираль или клубок.

Гидрофильность растворов ВМС. Одно из важнейших свойств высокомолекулярных соединений — гидрофильность. Гидрофильность искусственных полимеров обусловлена двойными связями, аминными и спиртовыми группировками.

Гидрофильность природных полимеров обусловлена главным образом пептидными, эфирными, двойными связями, карбоксильными, карбонильными, спиртовыми и аминными группами. Различают диссоциированные [ионогенные] гидрофильные группы и недиссоциированные [полярные] группы.

Ионогенные гидрофильные группы: R—СООН, R—СООNa, R—NН₃ОН, R—NH₃Cl.

Диссоциация ионогенных групп обеспечивает ВМС электрический заряд, а полярные группы притягивают диполи воды, образующие гидратную оболочку. Именно это и делает растворы биополимеров устойчивыми к коагулирующему действию электролитов. Итак, устойчивость растворов ВМС определяется двумя факторами: наличием заряда и наличием гидратной оболочки, причём главным фактором является водная оболочка. Она препятствует коагуляции даже в изоэлектрическом [электронейтральном] состоянии. Образование третичной и четвертичной

структуры у белков не случайно — при такой укладке все гидрофильные группы находятся снаружи.

 

Примеры решения задач

 

Пример 1.

Какой заряд имеют альбумины (pI=4,9) и глобулины (pI=7) в крови.

Решение:

рН крови в среднем 7,36, так как изоэлектрическая точка ниже заряд белки имеют отрицательный, причем альбумины имеют заряд ниже, чем глобулины.

 

Пример 2.

При рН=6,0 инсулин при электрофорезе остается на старте. К какому электроду инсулин будет перемещаться в 0,1 М растворе соляной кислоты?

Решение:

ИЭТ инсулина равна 6,0, т.е. белок не имеет заряда. рН (НСI) = - lgC(H⁺ ) = - lg10^-1 =1. В кислой среде инсулин будет иметь заряд (+), следовательно инсулин будет передвигаться к катоду.

 

Пример 3.

Изоэлектрическая точка белка миозина равна 5,0. При каких значениях рН: 2,4,5 или 7 электрофоретическая подвижность будет наибольшей?

Решение:

При рН=2 и при рН=4 происходит ионизация -NH₂ , причем при рН=2 - в большей степени. При рН=5 ионизация отсутствует, электрофоретическая подвижность не наблюдается. При рН=7 происходит ионизация групп –СООН. Наибольшая электрофоретическая подвижность миозина наблюдается при рН=2, так как разность между значением ИЭТ и рН буферного раствора максимальна, частица белка имеет при этом наибольший положительный заряд.

 

Задачи для самостоятельного решения

1. К какому электроду будут передвигаться частицы белка (рI =4,0) при электрофорезе в ацетатном буфере, приготовленном из 10 мл раствора ацетата натрия с концентрацией 0,1 моль/л и 50 мл 0,2 моль/л уксусной кислоты (рК_{кислоты} =4,76)?

2. Будет ли происходить набухании е желатины (рI=4,7) в ацетатном буфере, приготовленном из 10 мл ацетата натрия и 100 мл уксусной кислоты (одинаковых концентраций) (рК=4,76).

3. Изоэлектрическая точка пепсина желудочного сока равна 2,0. Как будет заряжен этот белок при нормальной кислотности желудочного сока взрослого человека. Ответ поясните.

4. В двух пробирках раствор белка, имеются два электролита: сульфат натрия и хлорид свинца. Какой из электролитов необходимо добавить для осаждения белка без нарушения структуры? Каков механизм осаждения белков при использовании этих электролитов?

5. Назовите и опишите реакции осаждения белка, применяемые в клинике. Почему эти реакции наиболее надёжны?

6. К какому электроду будут передвигаться при электрофорезе белки b-лактоглобулины в буферном растворе с рН=8,6, если при рН=5,2 белок остается на старте?

7. В какой среде необходимо прокипятить сыворотку крови для полного удаления белков, если ИЭТ белков крови меняется от 4,5 до 6,0?

8. Какие реактивы необходимо использовать:

а) для получения безбелкового фильтрата крови;

б) для выделения белков для дальнейшего изучения структуры белков.

9. Имеются следующие реактивы: сульфосалициловая кислота, конц.H₂SO₄ , крист. (NH₄)₂SO₄, трихлоруксусная кислота, насыщ. раствор хлорида натрия. Объясните выбор растворов и механизм осаждения в каждом случае.

10. ИЭТ гемоглобина рН = 6,68. Белок поместили в буферный раствор с концентрацией ионов водорода 10-6 моль/л. Определите направление движения молекул гемоглобина при электрофорезе. Известно, что рН в эритроцитах равен 7,25. Какой заряд имеют белковые молекулы гемоглобина при этом значении рН?

11. К какому электроду будут передвигаться частицы белка (ИЭТ = 4,0) при электрофорезе в ацетатном буфере, приготовленном из 100 мл раствора ацетата натрия с концентрацией 0,1 моль/л и 50 мл раствора уксусной кислоты с концентрацией 0,2 моль/л? (рК_{кислоты}=4,76)

 

Тестовые задания