Питательные среды и микробиологическое исследование

Микробиологическое исследование — это выделение чистых культур микроорганизмов, культивирование и изучение их свойств. Чистыми называются культуры, состоящие из микроорганизмов одного вида. Они нужны при диагностике инфекционных болезней, для определения видовой и типовой принадлежности микробов, в исследовательской работе, для получения продуктов жизнедеятельности микробов (токсинов, антибиотиков, вакцин и т. п.).

Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты — питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются и т. д.), поэтому их еще называют «средами для культивирования».

Питательные среды

Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов.

Требования, предъявляемые к средам

Среды должны соответствовать следующим условиям:

1) быть питательными, т. е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы. Минеральные вещества не только входят в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства сред (осмотическое давление, рН и др.). При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста — витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать;

Внимание! Микроорганизмы, как все живые существа, нуждаются в большом количестве воды.

2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов — рН, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2—7,4). Исключение составляют холерный вибрион — его оптимум находится в щелочной зоне

(рН 8,5—9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2—6,8).

Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т. е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена;

3) быть изотоничными для микробной клетки, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида;

4) быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав, рН и др.);

5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию;

6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом. Для одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других — низкий. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы — при RH2 не ниже 10. Окислительно-восстановительный потенциал большинства сред удовлетворяет требованиям к нему аэробов и факультативных анаэробов;

7) быть по возможности унифицированным, т. е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Так, среды для культивирования большинства патогенных бактерий должны содержать 0,8—1,2 гл амин-ного азота NH2, т. е. суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5—3,0 гл общего азота N; 0,5% хлоридов в пересчете на натрия хлорид; 1% пептона.

Желательно, чтобы среды были прозрачными — удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами.

Классификация сред

Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме того, на выбор той или иной среды влияют цели исследования.

В настоящее время предложено огромное количество сред, в основу классификации которых положены следующие признаки.

1. Исходные компоненты. По исходным компонентам различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения. В настоящее время разработаны среды, в которых ценные пищевые продукты (мясо и др.) заменены непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Несмотря на то, что состав питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и меняется в зависимости от исходного сырья, эти среды нашли широкое применение.

Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворенных в дважды дистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен (известно, сколько и какие вещества в них входят), поэтому эти среды легко воспроизводимы.

2. Консистенция (степень плотности). Среды бывают жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких веществ, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин.

Агар-агар — полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Он не является для микроорганизмов питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В воде агар плавится при 80— 100°С, застывает при 40—45°С.

Желатин — белок животного происхождения. При 25— 30°С желатиновые среды плавятся, поэтому культуры на них обычно выращивают при комнатной температуре. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшается, и они плохо застывают. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество — при их росте среда разжижается.

Кроме того, в качестве плотных сред применяют свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель, среды с селикагелем.

3. Состав. Среды делят на простые и сложные. К первым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.

4. Назначение: а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МП А, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода; б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков — сыворотку крови, для возбудителя коклюша — кровь; в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Так, соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН.

Жидкие элективные среды называют средами накопления. Примером такой среды служит пептонная вода с рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут; г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды; д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды — глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий.

Практическая часть

Приготовление сред

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 мин в 1—2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде. (Посудой, предназначенной для приготовления сред, нельзя пользоваться в других целях, например для хранения химических реактивов или дезинфицирующих растворов — даже следы этих веществ могут помещать росту микроорганизмов.)

Исходным сырьем для приготовления большинства сред служат продукты животного или растительного происхождения: мясо и его заменители, молоко, яйца, картофель, соя, кукуруза, дрожжи и др.

Основные питательные бульоны готовят на мясной воде или на различных переварах, полученных при кислотном или ферментативном гидролизе исходного сырья. Бульоны из переваров в 5—10 раз экономичнее, чем из мясной воды. Среды на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее; обладают большей буферностью, т. е. имеют более стабильную величину рН. Кроме того, препараты можно готовить из заменителей мяса (сгустков крови, плаценты, казеина и т. д.).

В настоящее время снабжение лабораторий мясной водой и переварами централизовано. Чаще пользуются панкреатическим переваром Хоттингера, гидролизатами казеина или кормовых дрожжей. Из этих полуфабрикатов, по определенным рецептам, готовят необходимые среды.

Этапы приготовления сред: 1) варка; 2) установление оптимальной величины рН; 3) осветление; 4) фильтрация; 5) разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

Установление рН сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рН используют потенциометр.

Разливают среды в пробирки (по 3—5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрицы и бутылки не более чем на 23 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100°С, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно разли вают в стерильную посуду.

Разливают среды с помощью воронки, на конец которой* надета резиновая трубка с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы-пипетки и т. п.

Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и той ее приготовления.

Стерилизация. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в ее рецепте. Примерная схема режима сте-| рилизации сред приведена в таблице.

Режим стерилизации сред

Режим стерилизации |Ц

Аппарат

Температура, давление

Простые

Автоклав

120°С (1 атм)

20 мин

Сложные: 1) с углеводами, молоком, желатином

Автоклавирование с закрытой крышкой или аппарат Коха

100°С (текучий пар)

30— 60 мин 3 дня подряд (дробная стерилизация)

2) белковые (сывороточные или яичные) с уплотнением

Свертыватель Коха (возможны два режима)

80-85°С

1 ч 3 дня подряд

1 ч однократно |

3) белковые, жидкие

Водяная баня или инактиватор

1 ч 3 — 4 дня подряд Ш

Контроль готовых сред: а) для контроля стерильности среды ставят в термостат на 2 сут., после чего их просматри-^ вают. Если на средах не появятся признаки роста, их считают стерильными и передают для химического контроля пс несколько образцов каждой серии; б)химический контроль: окончательно устанавливают рН, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (ил количество должно соответствовать указанному в рецепте).

Химический контроль сред производят в химической лаборатории; в) для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных (ростовых) свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контроля и др.

Хранят среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Некоторые среды, например, среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.

Рецепты приготовления простых (основных) сред и изотонического раствора натрия хлорида

Изотонический раствор натрия хлорида. К 1 л дистиллированной воды добавляют 9 г натрия хлорида. Раствор фильтруют, устанавливают заданный рН и, если нужно, стерилизуют при 120°С в течение 30 мин.

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5% х. ч. натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10—15 мин для растворения веществ, устанавливают нужный рН и снова кипятят 30—40 мин до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначальною объема водой и стерилизуют 20 мин при 120°С.

Бульон Хоттингера. Перевар Хоттингера разводят водой 5—6 раз в зависимости от того, какое количество аминного азота он содержит и какое его количество должно быть в бульоне (указано в паспорте перевара и рецепте среды). Например, для приготовления среды с 1,2 гл аминного азота перевар, содержащий 9,0 гл, надо развести в 7,5 раз (9,0: 1,2). К разведенному перевару прибавляют 0,5% натрия хлорида и кипятят на слабом огне до растворения соли. В остывшей среде устанавливают рН, фильтруют, разливают и стерилизуют 20 мин при 120°С.

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону (до стерилизации или после нее) добавляют 2—3% измельченного агар-агара и кипятят, помешивая, на слабом огне до; полного расплавления агара. МПА можно варить в автоклаве или аппарате Коха. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120°С. Полужидкий агар содержит 0,4—0,5% агар-агара.

Питательный желатин. К готовому бульону прибавляют 10—15% желатина, подогревают до его расплавления (не кипятят!), разливают в стерильную посуду и сте-i рилизуют текучим паром.

Рецепты приготовления сложных сред Среды с углеводами. К основному бульону или расплав-1 ленному агару прибавляют нужное количество (0,1—2%) определенного углевода (например, глюкозы). После его растворения разливают в стерильную посуду и стерилизуют] текучим паром. Поскольку углеводы частично разрушаются даже при таком режиме стерилизации, предпочтительнее 25— 30% раствор углеводов, простерилизованный через бактериальный фильтр, добавлять в нужном объеме с соблюдением | асептики к стерильным основным средам. После контроля] стерильности среда готова к употреблению.

Среды с кровью готовят из стерильных простых сред, добавляя в асептических условиях (лучше в боксе) от 3 дс 30% (обычно 5%) стерильной дефибринированной крови. Агаровые среды перед этим растапливают и остужают дс 45 °С. При нужной температуре должно быть терпимое ощущение горячего, но не ожога. После добавления крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тщательно перемеши* вают и разливают в чашки или пробирки.

Внимание! Среды с кровью растапливать нельзя — кровь изме-| нит свои свойства. Среды с сывороткой крови готовят так же, как среды кровью. К основным средам добавляют 10—20% сыворотки, не содержащей консерванта и предварительно инактиви-рованной при 56°С в течение 30 мин на водяной бане или: инактиваторе. При инактивации разрушается вещество (комплемент), губительно действующее на микробы.

Среды с желчью. К простым средам добавляют желчь в количестве 10—40% объема среды, устанавливают нужный рН и стерилизуют 20 мин при 120°С. Можно стерильную желчь добавить к стерильной среде в асептических условиях.

Разлив агаровых сред в чашки Петри. Среды перед разливом расплавляют на водяной бане и остужают до 45—50°С. Обычно для чашки диаметром 9 см достаточно 15—20 мл среды (высота слоя 0,25—0,3 см). Если слой выше, на нем менее контрастно выглядят колонии. При очень тонком слое резко ограничено количество питательных веществ и влаги (среда быстро высыхает) — ухудшаются условия культивирования.

Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях. Чашки ставят крышкой вверх. Сосуд со средой берут в правую руку, держа его у огня. Левой рукой вынимают пробку, зажав ее мизинцем и ладонью. Обжигают горлышко сосуда и двумя пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. Вводят под нее горлышко флакона, не прикасаясь им к краю чашки. Наливая среду, следят, чтобы она равномерно распределилась по дну чашки. Если при разливе на поверхности среды образуются пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, подносят пламя спички или горелки — пузырьки лопнут. Затем чашку закрывают и дают среде застыть. Если посев производят в день разлива, среду необходимо подсушить. Для этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки открытой стороной вниз на 20—30 мин. Если посев производят на следующий день после разлива, чашки, не подсушивая, завертывают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали, и помещают в холодильник.

Приготовление скошенного агара. Пробирки с 4—5 мл стерильной расплавленной агаровой среды укладывают в наклонном положении (примерно под углом 20°) с таким расчетом, чтобы среда не заходила за 23 пробирки, иначе она Может смочить пробку. После того как среда застынет, пробирки ставят вертикально — дают стечь конденсату. Лучше употреблять свежескошенный агар.

Внимание! Пользоваться средой, в которой нет конденсата, нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.

Сухие среды

Отечественная промышленность выпускает сухие среды разного назначения: простые, элективные, дифференциально-диагностические, специальные. Это порошки во флаконах с завинчивающимися крышками. Хранят сухие среды в темном месте плотно закрытыми — они гигроскопичны. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи на этикетке.

Преимущество сухих сред по сравнению со средами, изготовленными в лаборатории, — стандартность (их выпускают большими партиями), простота приготовления, делающая их доступными в любых (даже походных) условиях, стабильность, экономичность. Важно, что их можно готовить из заменителей мяса: гидролизата казеина, фибрина кильки и даже белковых фракций микробных клеток (са] цин).

Методы посевов

Важным этапом бактериологического исследования ляется посев. В зависимости от цели исследования, харак ра посевного материала и среды используют разные методь посева. Все они включают обязательную цель: оградить пс сев от посторонних микробов. Поэтому работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебан* воздуха. Во время посевов нельзя разговаривать. ПосевМ лучше делать в боксе (при работе с заразным материалол необходимо выполнять правила личной безопасности).

Этапы выделения чистой культуры:

1-й день — получение изолированных колоний. Кашп исследуемого материала петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность агара в чашке Петри. Шпа-i телем втирают материал в поверхность среды; не прожиг и не перевертывая шпателя, производят посев на 2-й, а тем на 3-й чашке. При таком посеве на 1-ю чашку приходится много материала и соответственно много микробов, на 2-ю меньше и на 3-ю еще меньше.

Можно получить изолированные колонии при посеве петлей. Для этого исследуемый материал эмульгируют в бульоне или изотоническом растворе натрия хлорида.

2-й день — изучают рост микробов на чашках. В 1-й чашке обычно бывает сплошной рост — выделить изолированную колонию не удастся. На поверхности агара во 2-й и 3-й чашке вырастают изолированные колонии. Их изучают невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и иногда в стереоскопическом микроскопе. Нужную колонию отмечают со стороны дна чашки и пересевают на скошенный агар. Посевы ставят в термостат. (Пересевать можно только изолированные колонии.)

3-й день — изучают характер роста на скошенном агаре. Делают мазок, окрашивают его и, убедившись в том, что культура чистая, приступают к ее изучению. На этом выделение чистой культуры заканчивается. Выделенная из определенного источника и изученная культура называется «штаммом».

При выделении чистой культуры из крови (гемокуль-туры) ее предварительно «подращивают» в жидкой среде: 10—15 мл стерильно взятой крови засевают в 100—150 мл жидкой среды. Так поступают потому, что в крови обычно мало микробов. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1: 10 не случайно — так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы). Колбы с посевом ставят в термостат. Через сутки (иногда через большее время, в зависимости от выделяемой культуры) из содержимого колб делают высевы на чашки для получения изолированных колоний. При необходимости повторяют высевы с интервалом в 2—3 дня.

При выделении чистой культуры из мочи, промывных вод желудка и других жидкостей их предварительно центрифугируют в асептических условиях и засевают осадок. Дальнейшее выделение чистой культуры производят обычным способом.

Для выделения чистой культуры широко применяют элективные среды. В ряде методов для получения чистых культур используют биологические особенности выделяемог микроба. Например, при выделении спорообразующих бак- терий посевы 10 мин прогревают при 80°С, убивая этим ве- гетативные формы. При выделении возбудителя туберкуле-j за, устойчивого к кислотам и щелочам, с помощью этих ве-1 ществ посевной материал освобождают от сопутствующей! флоры. Для выделения пневмококка и палочки чумы иссле-1 дуемый материал вводят белым мышам — в их организме высокочувствительном к данным возбудителям, эти микро-] бы размножаются быстрее других.

В научно-исследовательской работе, особенно при гене-; тических исследованиях, необходимо получать культуры за-1 ведомо из одной клетки. Такая культура называется «клон»] Для ее получения чаще всего пользуются микроманипуля-^ тором — прибором, снабженным инструментами (иглами] пипетками) микроскопических размеров. С помощью дер-j жателя под контролем микроскопа их вводят в препарат «B сячая капля», извлекают нужную клетку (одну) и переносят ее в питательную среду.

Изучение выделенных культур

Изучение морфологии, подвижности, тинкториальныл свойств, характера роста на средах (культуральные свойства);! ферментативной активности и ряда других особенностей вы! деленного микроба позволяет установить его таксономичес| кое положение, т. е. классифицировать микроорганизм: оп| ределить его род, вид, тип, подтип, разновидность. Это на зывается «идентификацией». Идентификация микроорганиз| мов очень важна при диагностике инфекций, установлена источников и путей ее передачи и в ряде других научно-л тических исследований.

Культуральные свойства

Различные виды микроорганизмов по-разному растут HJ| средах. Эти различия служат для их дифференциации. Оцщ хорошо растут на простых средах, другие — требовательнь и растут только на специальных. Микроорганизмы Moryi давать обильный (пышный) рост, умеренный или скудный Культуры могут быть бесцветными, сероватыми, серо-гсм лубыми. Культуры микроорганизмов, образующих пигмент, имеют разнообразную окраску: белую, желтую или золотистую у стафилококка, красную — у чудесной палочки, сине-зеленую — у сине-зеленой палочки, пигмент которой, растворимый в воде, окрашивает не только колонии, но и среду.

На плотных средах микроорганизмы в зависимости от количества посевного материала образуют или сплошной налет («газон»), или изолированные колонии. Культуры бывают грубые и нежные, прозрачные и непрозрачные, с поверхностью матовой, блестящей, гладкой, шероховатой, сухой, бугристой.

Колонии могут быть крупные (4—5 мм в диаметре и больше), средние (2—4 мм), мелкие (1—2 мм) и карликовые (меньше 1 мм). Они различаются по форме, расположению на поверхности среды (выпуклые, плоские, куполообразные, вдавленные, круглые, розеткообразные), форме краев (ровные, волнистые, изрезанные).

В жидких средах микроорганизмы могут образовывать равномерную муть, давать осадок (зернистый, пылевидный, хлопьевидный) или пленку (нежную, грубую, морщинистую).

На полужидких средах при посеве уколом подвижные микробы вызывают помутнение толщи среды, неподвижные — растут только по «уколу», оставляя остальную среду прозрачной.

Культуральные свойства определяют изучая характер роста культуры простым глазом, с помощью лупы, под малым увеличением микроскопа или пользуясь стереоскопическим микроскопом. Величину и форму колоний, форму краев и прозрачность изучают в проходящем свете, рассматривая чашки со стороны дна. В отраженном свете (со стороны крышки) определяют характер поверхности, окраску. Консистенцию определяют прикосновением петли.

Морфологические свойства

Изучение морфологии микробов тоже служит для их дифференциации. Морфологию изучают в окрашенных препаратах. Устанавливают форму и величину клеток, их расположение в препарате, наличие спор, капсул, жгутиков. В окрашенных препаратах определяют отношение микробов к краскам (тинкториальные свойства) — хорошо или плохо воспринимают краски, как относится к дифференциальным окраскам (в какой цвет окрашивается по Граму, Цилю—Нильсену и др.).