Роль ионов кальция в повреждении митохондрий

Итак, отсутствие кислорода в живой клетке приводит к повреждению прежде всего митохондрий. Что же произошло в клетке, без чего митохондрии разрушаются? В течение первых же пяти минут аноксии в клетках резко снижается уровень АТФ и накапливается молочная кислота (см. рис. 1). Снижение концентрации источника энергии не может не сказаться на работе ионных насосов, выкачивающих из клетки ионы кальция (Ca²⁺-АТФаза) и натрия (в обмен на калий, Na⁺-K⁺-АТФаза). Выключение натрий-калиевой АТФазы приводит к повышению осмотического давления в клетке и её набуханию. Отек ткани – характерный признак гипоксии, резко усугубляющий ситуацию, поскольку сжатие кровеносных сосудов ухудшает кровоснабжение и усугубляет кислородную недостаточность. Не менее драматичны последствия увеличения концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток. Именно эти ионы, как мы сейчас увидим, несут прямую ответственность за повреждение митохондрий в анаэробных условиях. На рис. 2 приведены данные опытов, в которых изолированные митохондрии инкубировались в аэробных (+O₂) и анаэробных условиях (-O₂) в присутствии (+Ca²⁺) и в отсутствие (-Ca²⁺) ионов кальция, добавленных в относительно низкой концентрации (около 10 мкМ, т.е. порядка 10^-5М). Объяснение результатов этого опыта дано на рис. 3. На рисунке дано схематическое изображение митохондрий. В отсутствие ионов кальция и кислорода (А) митохондрии могут некоторое время существовать, не повреждаясь. Введение кислорода (при наличии субстратов окисления) приводит к "энергизации" (Б), основным проявлением которой служит появление разности потенциалов на внутренней мембране (знак "минус" внутри). В присутствии ионов кальция и при отсутствии кислорода в среде (В) митохондрии повреждаются (см. также Д и Е). Но если наряду с кальцием в среде присутствует кислород (Г), ионы кальция "заглатываются" митохондриями и, находясь внутри, уже не оказывают своего повреждающего действия.

Фосфолипаза A₂ повреждает мембраны митохондрий

Рисунки 3, Д и Е объясняют причину повреждающего действия внемитохондриального кальция. Дело в том, что внутренние мембраны митохондрий содержат фермент, фосфолипазу A₂, который расщепляет фосфолипиды мембран и делает мембраны проницаемыми для ионов. Этот фермент активируется ионами кальция, которые находятся снаружи, но не внутри митохондрий (Д). Поврежденные фосфолипазой митохондрии (Е), хотя и могут потреблять кислород, но не могут удержать мембранный потенциал, не удерживают внутри ионы кальция и не способны к синтезу АТФ. Клетка, содержащая такие митохондрии, уже не жизнеспособна. Гидролиз фосфолипазой липидов мембран сопровождается накоплением свободных жирных кислот, которые можно определять, используя те или иные методы биохимического анализа. Caм по себе факт накопления жирных кислот при ишемии был известен довольно давно, но роль этого явления в нарушении функций митохондрий стала несомненной только после сопоставления уровня накопившихся в митохондриях свободных жирных кислот и степени повреждения митохондрий. Один из таких опытов приведен на рис. 4. Результаты опыта очевидны: в аэробных условиях не накапливаются жирные кислоты, и митохондрии не повреждаются, а в анаэробных условиях происходит и то и другое. Отчетливый параллелизм между глубиной гидролиза фосфолипидов и поражения митохондрий проявляется также при ингибировании фосфолипазы местными анестетиками или ионами меди. Эти данные приведены на рис. 5. На этом рисунке можно видеть, что исходные митохондрии печени крысы имели степень интактности (СИ) 100% и содержали около 20 мкмолей свободных жирных кислот (ЖК) на мг белка. Степень интактности определялась как (ДК – 1) x 100%, где ДК – коэффициент дыхательного контроля, т.е. отношение скоростей потребления кислорода митохондриями в третьем и четвертом функциональных состояниях. После 20 мин инкубации в анаэробных условиях в присутствии 35 мкМ CaCl₂ митохондрии содержали 54 нмоля ЖК на мг белка и имели нулевую степень интактности (ДК = 1). ЕГТА, связывая кальций, полностью сохраняла и содержание ЖК, и интактность митохондрий на исходном уровне неповрежденных органелл. Ингибиторы фосфолипазы: ионы меди и местный анестетик совкаин,– уменьшали степень гидролиза фосфолипидов (ЖК) и снижали повреждение митохондрий (сохраняли СИ). Данные, полученные в такого рода опытах можно представить в виде зависимости степени интактности митохондрий от содержания свободных жирных кислот (образующихся в результате гидролиза фосфолипидов фосфолипазой A₂), как это показано на рис. 6. Можно видеть, что между этими величинами имеется четкая обратная зависимость: чем выше степень гидролиза фосфолипидов, тем сильнее повреждены митохондрии (т.е. тем меньше степень интактности). Все эти результаты подтверждают вывод о том, что именно гидролиз фосфолипидов внутренней мембраны митохондрий, катализируемый фосфолипазой A₂ в результате ее активации ионами кальция, находящимися вне митохондрий, приводит к повреждению органелл при гипоксии.