Бактериофаги. Морфология. Вирулентные и умеренные фаги. Лизогения. Фаговая конверсия. Применение.

Занятие 5

Бактериофаги. Морфология. Вирулентные и умеренные фаги. Лизогения. Фаговая конверсия. Применение.

Вирусы бактерий (бактериофаги).

Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.

Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется наличием головки- икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т.е. внешне несколько напоминают сперматозоид.

Взаимодействие фагов с клеткой (бактерией) строго специфично, т.е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий.

1.Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).

2.Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.

3.Репродукция фага.

4.Выход дочерних популяций.

Основные свойства фагов.

Различают вирулентные фаги, способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги, вызывающие фаговую конверсию. В последнем случае геном фага в клетке не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении. Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией. Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка- репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями - в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина. Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру действия на бактерии фаги разделяют на:

- поливалентные (лизируют близкородственные бактерии, например сальмонеллы);

- моновалентные (лизируют бактерии одного вида);

- типоспецифические (лизируют только определенные фаговары возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) - теста (образование негативного пятна при росте колоний) или методом агаровых слоев (титрования по Грациа). Смотри протокол (методы выявления фагов!).

Практическое использование бактериофагов.

1.Для идентификации бактерий (определение фаготипа при фаготипировании). Используется для эпидемиологического анализа!!!

2.Для фагопрофилактики (купирование вспышек).

3.Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).

Занятие 6

Наследственность – это способность сохранять и передавать исходные видовые признаки из поколения в поколение.

Ген – наследственный фактор, единица наследственного материала – определенный участок молекулы ДНК у высших организмов (РНК у ряда вирусов), ответственный за синтез определенного белка.

Генотип - совокупность всех генов организма, его наследственная материальная основа.

Фенотип - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся на основе взаимодействия генотипа с условиями внешней среды.

Генетический материал у бактерий содержится в нуклеоиде (бактериальной хромосоме) и во внехромосомных генетических элементах — плазмидах и мигрирующих генетических элементах (транспозоны и IS-последовательности).

Организация ДНК у бактерий:

n нуклеоид (бактериальная хромосома) кодирует жизненно важные признаки

Молекула ДНК (нуклеоид) представляет собой замкнутую, спирально закрученную двунитчатую структуру, свободно располагающуюся в цитоплазме. Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии составляет приблизительно 1 мм.

n внехромосомные генетические элементы

не жизненно важные признаки. Относятся:

1. Транспозоны: Нуклеотидные поледовательности (от 2 000 до 20 000 пар нуклеотидов), способные менять место своей локализации в молекуле ДНК (и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую)

2. IS-последовательности: Вставки нуклеотидных последовательностей (более 1 000 пар нуклеотидов)

1. Функция: Координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации

2. Регуляторная (регуляция транскрипции генов путем их «включения/выключения")

3. Индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5 – 9 пар нуклеотидов)

 

3. Плазмиды - внегеномные элементы, представляющие собой циркулярную двухцепочечную ДНК, реплицирующиеся автономно от геномной ДНК. Большинство плазмид распространяется конъюгативным путем, часть - при трансформации и трансдукции. Выделяют автономные (не связанные с хромосомой бактерий) и интегрированные (встроенные в хромосому) плазмиды.

Фенотипическая изменчивость. Модификации. Примеры.

Модификации - временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие как адаптивные реакции бактерий на изменения окружающей среды. Модификации находятся под контролем генома, но не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются. Модификации проявляются в изменении морфологических, биохимических и ряда других признаков.

Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее расщепления.

Выделяют 2 вида модификационной изменчивости:

а) стабильную (длительную) модификацию. Она сохраняется в потомстве в течение нескольких поколений.

б) кратковременную модификацию. Она исчезает сразу после прекращения действия фактора, вызвавшего ее.

Модификации могут возникать под действием антибиотиков. При этом образуются L-формы, лишённые клеточной стенки. После прекращения действия пенициллина происходит реверсия – возврат к исходному фенотипу.

При выращивании многих бактерий на питательной среде с бактериостатическими концентрациями антисептиков (фенол, например) также можно получить модификации (например, утрата жгутиков).

Диссоциации у бактерий.

R-S-диссоциация бактерий - это образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип — R-колонии (англ. rough — неровный) — характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип — S колоний (англ. smooth — гладкий) - имеет круглую форму, гладкую поверхность.

Диссоциацию большинство ученых рассматривают как закономерную форму модификации, а некоторые относят ее к мутациям. В основе диссоциации лежат изменения в структуре липополисахарида (ЛПС) клеточной стенки грамотрицательных микроорганизмов

Процесс диссоциации обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний (исключение – чумная палочка, бациллы сибирской язвы, микобактерии туберкулеза).

В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды!

Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются во внешней среде.

S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику инфекционных заболеваний.

Свойства бактерий из S- и R-колоний

S-колонии	R-колонии
Гладкие с ровными краями	Шероховатые с изрезанными краями
Диффузно-мутящий рост в МПБ	Придонный рост в МПБ
Обычно вирулентны	Обычно не вирулентны, за исключением возбудителей туберкулеза, сибирской язвы, дифтерии, чумы
У капсульных видов есть капсула	Капсула отсутствует
У подвижных видов есть жгутики	Жгутики отсутствуют
Чувствительны к фагу	Мало чувствительны к фагу
Биохимически более активны	Биохимически менее активны
Полноценны в антигенном отношении	Неполноценны в антигенном отношении

КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ

По происхождению

§ Спонтанные

§ Индуцированные

По локализации в клетке

§ Ядерные

§ Цитоплазматические (мутации внеядерных генов)

Типы трансдукций

1. Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора. В клетки реципиентного штамма могут быть перенесены любые гены донора. Фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим. Фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов.

2. Специфическая трансдукция осуществляется фагами, обладающими избирательной локализацией на хромосоме бактерий. Образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом. При взаимодействии фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.

3. Абортивная трансдукция. Принесенный фагом фрагмент ДНК донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а остается в ее цитоплазме и в таком виде способен поддерживаться и проявляться фенотипически.

Во время деления бактериальной клетки фрагмент ДНК может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве.

Вариантом специфической трансдукции является Фаговая (лизогенная) конверсия. Это изменения свойств бактерии-реципиента под влиянием генов умеренного фага.

Механизмы фаговой конверсии:

встраивание бактериофага в нуклеоид
ò 1. Активация гена бактериофага ò	ò 2. Внесение гена от бактерии-донора (дефектные фаги при трансдукции) ò	3.Встраивание около повреждённого промотора ò замена его фаговым промотором ò экспрессия «молчащих» генов бактерии-реципиента
появление у бактерии-реципиента нового признака

Трансформация -перенос генетического материала от одного организма к другому, где посредством генетической рекомбинации часть трансформирующей молекулы ДНК может обмениваться с частью хромосомной ДНК донора.

Трансформация бактерий — форма генетической изменчивости, при которой бактерия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК бактерии-донора. Это приводит к образованию рекомбинантных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских клеток.

Впервые феномен трансформации был установлен Ф. Гриффитсом в 1928 г. на модели бескапсульного и капсульного пневмококков. Для проведения опыта использовали трех белых мышей. Первую мышь заражали живыми, бескапсульными (невирулентными) пневмококками. Второй мыши вводили убитую культуру капсульных (вирулентных) пневмококков; третьей мыши — смесь живых невирулентных пневмококков и убитых вирулентных пневмококков. В результате опыта в живых оставались первая и вторая мыши; погибала третья мышь, так как живые бескапсульные пневмококки поглощали фрагменты ДНК убитых капсульных и сами превращались в капсульные (вирулентные) пневмококки. Механизм такой трансформации оставался неясным в течение 16 лет. В 1944 г. осуществили трансформацию бескапсульных пневмококков в капсульные in vitro. Они добавили к культуре бескапсульных пневмококков ДНК, выделенную из капсульных пневмококков, в результате чего бескапсульные превратились в капсульные и стали вирулентными для мышей. Опыт доказал, что носителем единиц наследственности (генов) является ДНК.

Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз:

1) адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте;

2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента;

3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией.

Эффективность трансформации зависит от степени гомологичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание, и тем больше образуется рекомбинантных бактерий. Межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая.

Очистка HBs-Ag

ò

Полимеразная цепная реакция

Цели

обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры

идентификация микроорганизмов

генотипирование микроорганизмов

 

Принцип проведения

патологический материал или штамм микроорганизма

выделение ДНК

нагрев

расплетение ДНК на две нити

добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена)

охлаждение

связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена

добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов

нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров

повторение циклов (30-80) – накопление (амплификация) искомого гена

резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена

определение количества ДНК с помощью электрофореза

Занятие 7

Типы

► объектов внешней среды

Стерилизация

Дезинфекция

► живых организмов

Антисептика

Химиотерапия

 

В зависимости от целей применения антимикробные вещества подразделяют на несколько групп:

· антибиотики (вещества, которые в малых концентрациях специфически подавляют размножение или вызывают гибель определенных групп микробов и опухолевых клеток);

· антисептики (вещества, вызывающие гибель широкого круга микроорганизмов или предотвращают их размножение в/на тканях организма);

· дезинфектанты (вещества, уничтожающие микробов в/на объектах внешней среды);

· консерванты (вещества, препятствующие размножению микробов в пищевых продуктах, косметических средствах и других объектах).

Стерилизация

Стерилизация — полное обеспложивание объектов, при котором уничтожаются все формы микроорганизмов (вегетативные и споры).

Основы экологической микробиологии. Основные понятия.

Между собой

С объектами внешней среды

С макроорганизмом

Основные понятия экологической микробиологии

► Популяция

Микрофлора тела человека

► Облигатная

(постоянная = резидентная = аутохтонная)

Закономерно встречающаяся

► Факультативная

(случайная = транзиторная = аллохтонная)

Зависящая от:

Состояния иммунной системы

Кожа

► стафилококки

► кандиды

Ротовая полость

► более 100 видов

Желудок

► микрофлора бедна

Кишечник

► Преобладают:

Бифидобактерии,

Лактобактерии,

Бактероиды.

► В большом количестве:

E. сoli,

Энтерококк.

► В небольшом количестве:

Др. энтеробактерии,

Стафилококки,

Кандиды,

Клостридии.

Дыхательные пути

► стрептококки

► коринебактерии

► стафилококки

Ухо

► наружное – = кожа

► среднее и внутреннее – стерильны

Конъюнктива

► микрофлора бедна

Мочеполовая система

► микроорганизмы присутствуют в уретре (особенно – её нижней части)

► мочевой пузырь, мочеточники и почки – стерильны

► полость матки – стерильна

► состав микрофлоры влагалища зависит от степени чистоты (гинекологический термин), преобладают лактобактерии

Классификация антибиотиков

Антибиотики классифицируют и характеризуют по

· происхождению,

· химической структуре,

· механизму действия, спектру действия,

· частоте развития лекарственной устойчивости и др.

По происхождению различают антибиотики природные или естественные (получены из бактерий, грибов, животных, растений и т.п.), полусинтетические и синтетические.

По происхождению антибиотики могут быть:

- бактериального (полимиксин, грамицидин);

- актиномицетного (стрептомицин, левомицетин, эритромицин);

- грибкового (пенициллин);

- растительного (фитонциды);

- животного происхождения (интерфероны, лизоцим).

По направленности ингибирующего действия различают

· противобактериальные,

· противогрибковые

· противовирусные

· противопротозойные

· противоопухолевые

По химической структуре - тетрациклиновые, β-лактамы, макролиды, аминогликозиды, полипептиды, актиномицины, стрептомицины, ациклические, гетероциклические и др.

Классификация антибиотиков по эффекту воздействия действия – бактериостатические и бактерицидные.

Таблица. Классификация антибиотиков по механизму действия:

Механизм действия	Группы препаратов
I. Ингибиторы синтеза клеточной стенки	β-лактамы(пенициллины, цефалоспорины, монобактамы, карбапенемы)
II. Ингибиторы функций и структуры цитоплазматической мембраны	Полимиксины Бацитрацин Полиены
III. Ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот:
ингибиторы матричных функций ДНК	противоопухолевые АБ
ингибиторы РНК-полимеразы (транскрипции)	Рифампицин, актиномицин
ингибиторы ДНК-полимеразы (нарушение репликации ДНК)	Хинолоны, нитрофураны, новобиоцин
IV. Ингибиторы синтеза белка (нарушают сборку белка на рибосомах):
- нарушают последовательность аминокислот в пептидной цепочке(необратимо связываясь с 30S субъединицей рибосом)	Аминогликозиды и тетрациклины
- торможение синтеза белка в начале сборки пептидной цепи (связываются с 50S субъединицей рибосом)	Линкозамиды
- нарушение образования пептидных связей	Хлорамфеникол (левомицетин)
- нарушение наращивания пептидной цепи на рибосомах (связываются с 50S субъединицей рибосом)	Макролиды
V. Модификаторы энергетического метаболизма (антиметаболиты):
- ингибиторы синтеза фолиевой кислоты	Сульфаниламиды
- ингибиторы дигидрофолатредуктазы	Триметоприм
- антагонисты пиридоксина, антибактериальное действие за счет хелатирования металлов	Изониазид

Занятие 5

Бактериофаги. Морфология. Вирулентные и умеренные фаги. Лизогения. Фаговая конверсия. Применение.

Вирусы бактерий (бактериофаги).

Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.

Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется наличием головки- икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т.е. внешне несколько напоминают сперматозоид.

Взаимодействие фагов с клеткой (бактерией) строго специфично, т.е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий.

1.Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).

2.Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.

3.Репродукция фага.

4.Выход дочерних популяций.

Основные свойства фагов.

Различают вирулентные фаги, способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги, вызывающие фаговую конверсию. В последнем случае геном фага в клетке не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении. Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией. Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка- репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями - в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина. Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру действия на бактерии фаги разделяют на:

- поливалентные (лизируют близкородственные бактерии, например сальмонеллы);

- моновалентные (лизируют бактерии одного вида);

- типоспецифические (лизируют только определенные фаговары возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) - теста (образование негативного пятна при росте колоний) или методом агаровых слоев (титрования по Грациа). Смотри протокол (методы выявления фагов!).

Практическое использование бактериофагов.

1.Для идентификации бактерий (определение фаготипа при фаготипировании). Используется для эпидемиологического анализа!!!

2.Для фагопрофилактики (купирование вспышек).

3.Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).

Занятие 6

Наследственность – это способность сохранять и передавать исходные видовые признаки из поколения в поколение.

Ген – наследственный фактор, единица наследственного материала – определенный участок молекулы ДНК у высших организмов (РНК у ряда вирусов), ответственный за синтез определенного белка.

Генотип - совокупность всех генов организма, его наследственная материальная основа.

Фенотип - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся на основе взаимодействия генотипа с условиями внешней среды.

Генетический материал у бактерий содержится в нуклеоиде (бактериальной хромосоме) и во внехромосомных генетических элементах — плазмидах и мигрирующих генетических элементах (транспозоны и IS-последовательности).

Организация ДНК у бактерий:

n нуклеоид (бактериальная хромосома) кодирует жизненно важные признаки

Молекула ДНК (нуклеоид) представляет собой замкнутую, спирально закрученную двунитчатую структуру, свободно располагающуюся в цитоплазме. Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии составляет приблизительно 1 мм.

n внехромосомные генетические элементы

не жизненно важные признаки. Относятся:

1. Транспозоны: Нуклеотидные поледовательности (от 2 000 до 20 000 пар нуклеотидов), способные менять место своей локализации в молекуле ДНК (и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую)

2. IS-последовательности: Вставки нуклеотидных последовательностей (более 1 000 пар нуклеотидов)

1. Функция: Координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации

2. Регуляторная (регуляция транскрипции генов путем их «включения/выключения")

3. Индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5 – 9 пар нуклеотидов)

 

3. Плазмиды - внегеномные элементы, представляющие собой циркулярную двухцепочечную ДНК, реплицирующиеся автономно от геномной ДНК. Большинство плазмид распространяется конъюгативным путем, часть - при трансформации и трансдукции. Выделяют автономные (не связанные с хромосомой бактерий) и интегрированные (встроенные в хромосому) плазмиды.