Стадии получение рекомбинантных ( гибридных ) молекул ДНК 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Стадии получение рекомбинантных ( гибридных ) молекул ДНК



1. Получение исходного генетического материала – гена, кодирующего интересующий белок(признак)

· Необходимый ген может быть получен двумя способами: искусственный синтез или выделение природных генов

· Искусствееный синтез генов вне организма возможен двумя способами:

q Ферментативный синтез - «вырезание» необходимого гена из донорской ДНК клеток интересующего организма с помощью специальных ферментов – рестиктаз

v Рестриктазы – ферменты, относящийся к классу гидролитических ферментов (гидролаз), а именно к группе нуклеаз или эндонуклеаз – ферментам гидролизующим связи нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) внутри полимерной цепи по строго определённым последовательностям нуклеотидов; в настоящее время известно около 500 рестриктаз, специфичных к определённым триплетам

v Каждая рестриктаза режет молекулу ДНК только в том месте, где находится определённый триплет, который она может узнавать из множества других; в результате двойная нить ДНК разделяется на участки (гены)

v При разделениии ДНК образуются её фрагменты (гены), имеющие однонитевые, так называемые «липкие концы», имеющие комплементарные основания, которые в присутствии другого фермента могут соединяться (слипаться) с комплементарными им «липкими» концами другой ДНК, предварительно разрезанной рестриктазами

v Рестриктаза узнаёт свой триплет в молекуле ДНК любого происхождения – будь то одноклеточные организмы, растения, животные или человек, поэтому образованные липкие концы у молекул ДНК (генов) разного происхождения будут оканчиваться на одинаковые триплеты и способны комплементарно соединятся

q Химический

а) искусственный синтез гена in vitro из отдельных нуклеотидов (впервые синтезирован индийцем Г. Кораной в 1970 году)

б) копирование соответствующих матриц РНК (при этом используется фермент обратная транскриптаза, катализирующий реакции синтеза ДНК на м-РНК)

v Из клеток выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией нужного гена, и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК; затем и-РНК, спаренную с цепью ДНК, уничтожается специальным ферментом, а оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной второй цепи ДНК; получившаяся двойная спираль ДНК называется к-ДНК (комплементарная ДНК) и является искомым геном (к-ДНК не имеет интронов как все бактериальные гены)

v Искусственно синтезированы гены глобина человека, кролика, голубя, гены синтеза человеческого инсулина и сомато статина, гены митохондрии печени крыс и др.

2. Выделение ДНК - вектора и его рестрикция (разрезание)

· Вектор – фрагмент ДНК, с помощью которого осуществляется перенос какого-либо гена в клетку - хозяина

· В качестве вектора используют плазмиду или вирус

v Плазмиды – мелкие кольцевые двуцепочечные молекулы внехромосомной ДНК в клетках прокариот (бактерий); как правило несут гены, контролирующие признаки не связанные с жизненно важными функциями и способные самосотоятельно реплицироваться; при создании определённых условий в одной клетке можно получить тысячи копий плазмид; плазмиды способны проникать в другие клетки, преодолевая их мембраны

· Плазмиду (векторную кольцевую ДНК) разрезают (рестрикциируют) в одной точке, превращая её из кольцевой структуры в линейную

Рестрикция – разрезание ДНК рестрикционной эндонуклеазой на фрагменты с «липкими» концами

· У обоих молекул ДНК, т.е. у плазмиды и выделенного гена получены одинаковые липкие концы, вследствие использования одного вида рестриктаз

3. Смыкание выделенного гена с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК - лигирование

Лигирование – соединение фрагмента ДНК (гена) с ДНК плазмиды ферментом лигазой с образованием кольцевой рекомбинантной ДНК (вектора-плазмиды)

· Воссоединение плазмиды и с выделенным геном происходит в отдельной пробирке благодаря имеющимся на их липких концах комплементарных азотистых оснований

· Выделенный ген встраивается («вшивается») в место разреза плазмиды, а липкие концы замыкают линейную молекулу в кольцо; в результате образуется вектор, представляющий уже рекомбинантную молекулу ДНК (молекулу ДНК, содержащую инородный ген, называют ещё химерной молекулой)

· Чтобы сомкнуть выделенный ген с ДНК-вектора, используют ферменты – лигазы (ДНК – лигаза которые помогают липким концам соединиться

v Лигазы – класс ферментов, катализирующих реакции присоединения двух различных молекул ДНК друг к другу, а также восстановление её нормальной структуры после частичного повреждения

3. Трансформация или трансгенез – введени рекомбинантных плазмид-векторов в обработанные бактериальные клетки

· Вектор-плазмида (рекомбинантная ДНК) используется в качестве переносчика встроенного в него гена в клетку другого организма (бактериальную или животную клетку-реципиент), где на его основе будет осуществляться синтез белка по технологии микробиологического синтеза (являясь молекулой ДНК плазмида-вектор может успешно работать в клетке-реципиенте, когда в неё встроены чужие гены, изъятые из клеток растений, животных и даже человека; такие клетки и организмы называются трансгенными или химерными)

v Наиболее часто в качестве клетки-реципиента используется клетки кишечной палочки Е. coli или дрожжей; начинается молекулярное клонирование – получение колонии бактериальных клеток, содержащих молекулу рекомбинантной ДНК и синтезирующих заданный белок (все потомки трансфомированной бактерии называются клоном); с помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого необходимого гена человека или другого высшего организма

v С целью повышения проникновения рекомбинантных молекул ДНК в клетки их подвергают кратковременному воздействию сильного электического тока, которое создаёт полости в мембранах и делает их на короткое время проницаемыми

v Трансформированные бактерии вместе высевают на питательную среду (агар – агар), на которой они размножаются, образуя клониальные колонии

Скрининг – отбор среди колоний - клонов трансформированных бактерий, содержащих рекомбинантную ДНК

v Так создаются новые высокопродуктивные штаммы бактерий или соматических клеток, синтезирующих белки, имеющие коммерческую ценность, которые передаются в микробиологическую промышленность

v Сегодня накапливаются клонированные гены ДНК тканей человека иряда сельскохозяйственных животных и растений (в том числе и раковых клеток); коллекцию разных клонов называют клонотекой, геномной библиотекой или банком генов; для полной библиотеки генома человека требуется получить около 800 тыс. разных клонов; процесс выделения и клонирования генов в значительной степени автоматизирован

· Перенос генов даёт возможность преодолевать межвидовую изоляцию и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим

Достижения генной инженерии

· Введение генов эукариот в бактерии используется для микробиологического синтеза биологически активных веществ, которые в природе синтезируются только клетками высших организмов

· Синтез гормонов, всегда содержащихся у животных и человека в ничтожных количествах, но абсолютно необходимых для лечения широко распространённых патологий; их химический синтез очень трудоёмкий и дорогой, поэтому был синтезированы гены, которые кодируют синтез этих гормонов, сконструирован рекомбинантный организм, в состав генома которого входит запрограммированный ген, способный осуществлять синтез полноценного человеческого гормона

q Таким образом в ряде стран, в том числе и России, получают ряд гормонов (инсулин, гормон роста – соматотропин) и интерферон – универсальный природный фактор для борьбы с вирусными инфекциями

v Гормон роста человека – соматотропин вырабатывается в гипофизе и контролирует рост человеческого тела; его недостаток приводит к карликовости, соматотропин – единственное средства лечения детей, страдающих карликовостью из-за недостатка этого гормона; до развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов; с 1980 года соматотропин синтезируется в специально сконструированных клетках Е. coli (кишечной палочки), он доступен в больших количествах, его препараты биохомочески чисты и свободны от вирусных загрязнений

v Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий уровень сахара в крови и клетках получали раньше из поджелудочных желёз забиваемых свиней и коров, что обеспечивало инсулином только около 7 % больных сахарным диабетом во всём мире; с 1982 года этот гормон получают в промышленных масштабах из бактерии Е. coli,содержащих ген человеческого инсулина

· Перенос генов в растения – желаемые гены выделяются в чистом виде, а затем с помощью агробактерий вводятся в геном растений, что значительно повышает их устойчивость к неблагоприятным факторам, продуктивность, сохранность и транспортабельность(трансгенные полиплоидные формы бобовых – сои, паслёновых, овощных, зернорвых, фруктовых, ягодных, кормовых растений)

· Синтез генов гормонов роста и генов, связанных с молочной продуктивностью, и их последующее введение в организм сельскохозяйственных животных, что позволяет получить новые породы животных с повышеннй продуктивностью (ген, кодирующий синтез гормона роста у крупного рогатого скота, введённый в геном свиней приводит к появлению особей весом более 500 килограмм)

v Метод заключается во введении гена в яйцеклетку животного; полученное от такой яйцеклетки потомство будет содержать повышенное количество требуемого гена во всех клетках организма

Трансгенные организмы (растения и животные) – это организмы, геном которых изменён в результате генно-инженерного внедрения в него несвойственного им гена (рекомбинантной ДНК)

 



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2017-02-05; просмотров: 506; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 54.205.179.155 (0.009 с.)