Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Стадии получение рекомбинантных ( гибридных ) молекул ДНК
1. Получение исходного генетического материала – гена, кодирующего интересующий белок(признак) · Необходимый ген может быть получен двумя способами: искусственный синтез или выделение природных генов · Искусствееный синтез генов вне организма возможен двумя способами: q Ферментативный синтез - «вырезание» необходимого гена из донорской ДНК клеток интересующего организма с помощью специальных ферментов – рестиктаз v Рестриктазы – ферменты, относящийся к классу гидролитических ферментов (гидролаз), а именно к группе нуклеаз или эндонуклеаз – ферментам гидролизующим связи нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) внутри полимерной цепи по строго определённым последовательностям нуклеотидов; в настоящее время известно около 500 рестриктаз, специфичных к определённым триплетам v Каждая рестриктаза режет молекулу ДНК только в том месте, где находится определённый триплет, который она может узнавать из множества других; в результате двойная нить ДНК разделяется на участки (гены) v При разделениии ДНК образуются её фрагменты (гены), имеющие однонитевые, так называемые «липкие концы», имеющие комплементарные основания, которые в присутствии другого фермента могут соединяться (слипаться) с комплементарными им «липкими» концами другой ДНК, предварительно разрезанной рестриктазами v Рестриктаза узнаёт свой триплет в молекуле ДНК любого происхождения – будь то одноклеточные организмы, растения, животные или человек, поэтому образованные липкие концы у молекул ДНК (генов) разного происхождения будут оканчиваться на одинаковые триплеты и способны комплементарно соединятся q Химический а) искусственный синтез гена in vitro из отдельных нуклеотидов (впервые синтезирован индийцем Г. Кораной в 1970 году) б) копирование соответствующих матриц РНК (при этом используется фермент обратная транскриптаза, катализирующий реакции синтеза ДНК на м-РНК) v Из клеток выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией нужного гена, и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК; затем и-РНК, спаренную с цепью ДНК, уничтожается специальным ферментом, а оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной второй цепи ДНК; получившаяся двойная спираль ДНК называется к-ДНК (комплементарная ДНК) и является искомым геном (к-ДНК не имеет интронов как все бактериальные гены)
v Искусственно синтезированы гены глобина человека, кролика, голубя, гены синтеза человеческого инсулина и сомато статина, гены митохондрии печени крыс и др. 2. Выделение ДНК - вектора и его рестрикция (разрезание) · Вектор – фрагмент ДНК, с помощью которого осуществляется перенос какого-либо гена в клетку - хозяина · В качестве вектора используют плазмиду или вирус v Плазмиды – мелкие кольцевые двуцепочечные молекулы внехромосомной ДНК в клетках прокариот (бактерий); как правило несут гены, контролирующие признаки не связанные с жизненно важными функциями и способные самосотоятельно реплицироваться; при создании определённых условий в одной клетке можно получить тысячи копий плазмид; плазмиды способны проникать в другие клетки, преодолевая их мембраны · Плазмиду (векторную кольцевую ДНК) разрезают (рестрикциируют) в одной точке, превращая её из кольцевой структуры в линейную Рестрикция – разрезание ДНК рестрикционной эндонуклеазой на фрагменты с «липкими» концами · У обоих молекул ДНК, т.е. у плазмиды и выделенного гена получены одинаковые липкие концы, вследствие использования одного вида рестриктаз 3. Смыкание выделенного гена с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК - лигирование Лигирование – соединение фрагмента ДНК (гена) с ДНК плазмиды ферментом лигазой с образованием кольцевой рекомбинантной ДНК (вектора-плазмиды) · Воссоединение плазмиды и с выделенным геном происходит в отдельной пробирке благодаря имеющимся на их липких концах комплементарных азотистых оснований · Выделенный ген встраивается («вшивается») в место разреза плазмиды, а липкие концы замыкают линейную молекулу в кольцо; в результате образуется вектор, представляющий уже рекомбинантную молекулу ДНК (молекулу ДНК, содержащую инородный ген, называют ещё химерной молекулой) · Чтобы сомкнуть выделенный ген с ДНК-вектора, используют ферменты – лигазы (ДНК – лигаза которые помогают липким концам соединиться
v Лигазы – класс ферментов, катализирующих реакции присоединения двух различных молекул ДНК друг к другу, а также восстановление её нормальной структуры после частичного повреждения 3. Трансформация или трансгенез – введени рекомбинантных плазмид-векторов в обработанные бактериальные клетки · Вектор-плазмида (рекомбинантная ДНК) используется в качестве переносчика встроенного в него гена в клетку другого организма (бактериальную или животную клетку-реципиент), где на его основе будет осуществляться синтез белка по технологии микробиологического синтеза (являясь молекулой ДНК плазмида-вектор может успешно работать в клетке-реципиенте, когда в неё встроены чужие гены, изъятые из клеток растений, животных и даже человека; такие клетки и организмы называются трансгенными или химерными) v Наиболее часто в качестве клетки-реципиента используется клетки кишечной палочки Е. coli или дрожжей; начинается молекулярное клонирование – получение колонии бактериальных клеток, содержащих молекулу рекомбинантной ДНК и синтезирующих заданный белок (все потомки трансфомированной бактерии называются клоном); с помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого необходимого гена человека или другого высшего организма v С целью повышения проникновения рекомбинантных молекул ДНК в клетки их подвергают кратковременному воздействию сильного электического тока, которое создаёт полости в мембранах и делает их на короткое время проницаемыми v Трансформированные бактерии вместе высевают на питательную среду (агар – агар), на которой они размножаются, образуя клониальные колонии Скрининг – отбор среди колоний - клонов трансформированных бактерий, содержащих рекомбинантную ДНК v Так создаются новые высокопродуктивные штаммы бактерий или соматических клеток, синтезирующих белки, имеющие коммерческую ценность, которые передаются в микробиологическую промышленность v Сегодня накапливаются клонированные гены ДНК тканей человека иряда сельскохозяйственных животных и растений (в том числе и раковых клеток); коллекцию разных клонов называют клонотекой, геномной библиотекой или банком генов; для полной библиотеки генома человека требуется получить около 800 тыс. разных клонов; процесс выделения и клонирования генов в значительной степени автоматизирован · Перенос генов даёт возможность преодолевать межвидовую изоляцию и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим Достижения генной инженерии · Введение генов эукариот в бактерии используется для микробиологического синтеза биологически активных веществ, которые в природе синтезируются только клетками высших организмов · Синтез гормонов, всегда содержащихся у животных и человека в ничтожных количествах, но абсолютно необходимых для лечения широко распространённых патологий; их химический синтез очень трудоёмкий и дорогой, поэтому был синтезированы гены, которые кодируют синтез этих гормонов, сконструирован рекомбинантный организм, в состав генома которого входит запрограммированный ген, способный осуществлять синтез полноценного человеческого гормона q Таким образом в ряде стран, в том числе и России, получают ряд гормонов (инсулин, гормон роста – соматотропин) и интерферон – универсальный природный фактор для борьбы с вирусными инфекциями
v Гормон роста человека – соматотропин вырабатывается в гипофизе и контролирует рост человеческого тела; его недостаток приводит к карликовости, соматотропин – единственное средства лечения детей, страдающих карликовостью из-за недостатка этого гормона; до развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов; с 1980 года соматотропин синтезируется в специально сконструированных клетках Е. coli (кишечной палочки), он доступен в больших количествах, его препараты биохомочески чисты и свободны от вирусных загрязнений v Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий уровень сахара в крови и клетках получали раньше из поджелудочных желёз забиваемых свиней и коров, что обеспечивало инсулином только около 7 % больных сахарным диабетом во всём мире; с 1982 года этот гормон получают в промышленных масштабах из бактерии Е. coli,содержащих ген человеческого инсулина · Перенос генов в растения – желаемые гены выделяются в чистом виде, а затем с помощью агробактерий вводятся в геном растений, что значительно повышает их устойчивость к неблагоприятным факторам, продуктивность, сохранность и транспортабельность(трансгенные полиплоидные формы бобовых – сои, паслёновых, овощных, зернорвых, фруктовых, ягодных, кормовых растений) · Синтез генов гормонов роста и генов, связанных с молочной продуктивностью, и их последующее введение в организм сельскохозяйственных животных, что позволяет получить новые породы животных с повышеннй продуктивностью (ген, кодирующий синтез гормона роста у крупного рогатого скота, введённый в геном свиней приводит к появлению особей весом более 500 килограмм) v Метод заключается во введении гена в яйцеклетку животного; полученное от такой яйцеклетки потомство будет содержать повышенное количество требуемого гена во всех клетках организма Трансгенные организмы (растения и животные) – это организмы, геном которых изменён в результате генно-инженерного внедрения в него несвойственного им гена (рекомбинантной ДНК)
|
|||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-02-05; просмотров: 506; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 54.205.179.155 (0.009 с.) |