Обнаружение сибиреязвенной палочки в почве. 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Обнаружение сибиреязвенной палочки в почве.



15.1. Предварительная подготовка проб почвы включает следующее: навеску почвы в 5-30 г взбалтывают в течение 10 минут с 50-100 мл стерильной воды, а затем отстаивают. Надосадочную жидкость сливают, доводят по объему до 1-го литра стерильным физиологическим раствором; 0,5 л равными порциями фильтруют через 4 мембранных фильтра без прогревания, а вторые 0,5 л в колбах предварительно прогревают при температуре 65-70°С в течение 30 минут или при температуре 85°С в течение 15 – 20 минут и также фильтруют через 4 мембранных фильтра. Для проведения люминесцентно-серологического анализа 2 фильтра засевают на чашки с 0,7% МПА путем накладывания мембранного фильтра на питательную среду вверх поверхностью, через которую фильтровали почвенную взвесь, а с остальных фильтров делают смыв в стерильных чашках Петри, для чего на поверхность наносят 1 мл физиологического раствора. Смыв используют для введения белым мышам (тест капсулообразования in vivo) и исследования люминесцентно-серологическим методом.

Аналогично исследуются и фильтры, через которые профильтровывали прогретую надосадочную жидкость.

Для уничтожения вегетативных форм микроорганизмов (вместо прогревания загрязненного материала) к почвенной взвеси добавляют кристаллическую мочевину с избытком, чтобы на дне появился небольшой нерастворившийся осадок. Ставят или в водяную баню при 37°С на 5-10 минут, или в термостат на 30 минут. Осадок после обработки мочевиной высевают в 3-5 чашек с агаром. Через сутки появляется рост споровых форм аэробных микроорганизмов, которые подлежат дальнейшему изучению.

Предварительный положительный ответ (сигнальный) дается на основании специфического свечения материала в люминесцентно-серо-логическом анализе, капсулообразования in vivo и in vitro.

15.2. Микроскопическое (предварительное) исследование.

Световая микроскопия. Из поступившего материала готовят несколько мазков, которые подсушивают на воздухе и фиксируют в спирте с добавлением 3% перекиси водорода не более 30 мин. Окрашивают по Граму. В окрашенных мазках сибиреязвенный микроб представляет собой грамположительные палочки, располагающиеся короткими цепочками или попарно. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях форма сибирской язвы может быть не характерной (короткие, толстые или изогнутые, иногда зернистые палочки с вздутием посередине или на конце, возможно наличие «теней» микробов).

Люминесцентная микроскопия.

Мазки для люминесцентной микроскопии подсушивают на воздухе и фиксируют в этиловом спирте с 3% перекисью водорода в течение 30 мин. На высохшие фиксированные мазки наносят в рабочих разведениях, указанных на этикетке соответствующие диагностические сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные иммуноглобулины (люминесцентная споровая сыворотка, соматическая, капсульно-соматическая) в зависимости от исследуемого материала.

Мазки с нанесенными на них люминесцирующими иммуноглобулинами помещают во влажную камеру - чашку Петри или эксикатор с увлажненной 0,9% раствором хлорида натрия или дистиллированной водой фильтровальной бумагой или комочком ваты, выдерживают для окрашивания при 37°С в течение 20 мин. Затем их тщательно промывают два раза по 5 мин в 0,9% растворе хлорида натрия, затем в дистиллированной воде и высушивают на воздухе. Препараты покрывают покровными стеклами или просматривают немедленно без покровных стекол. Мазки микроскопируют в люминесцентном микроскопе с сис­темой подобранных светофильтров, под иммерсионным объективом.

Споры и вегетативные клетки сибиреязвенного микроба, окрашенные люминесцирующими иммуноглобулинами, дают яркое свечение периферии клеток, имеющих характерную для данного вида морфологию. Такое свечение называется специфическим, в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным неярким свечением всей поверхности клеток.

Посев на питательные среды.

Подготовленный материал для исследования засевают на чашки Петри с питательным агаром. Используют МПА, агар Хоттингера (рН 7,2-7,5) или дифференциально-диагностическую среду. Для засева одной пробы желательно использовать 5-10 чашек. Поверхность агара перед посевом должна быть совершенно сухой. Если материал значительно загрязнен посторонней микрофлорой делают посевы методом истощения, распределяя материал шпателем по поверхности агара с переносом на 2-3 чашки, используя при этом МПА, агар Хоттингера, кровяной агар и мясопептонный бульон (далее – МПБ). Посевы помешают в термостат при 37°С на 18-20 часов.

На следующий день посевы просматривают не только визуально, но и под малым увеличением микроскопа. На чашках, кроме сибиреязвенного микроба, наблюдается рост и других спорообразующих сапрофитов морфологически трудно отличимых от В. anthracis. Для сибиреязвенного микроба характерно образование крупных, шероховатых, матовых колоний, край которых напоминает локоны волос, состоящих из сплетений длинных нитей микробов, получивших название «головы медузы», «львиной гривы». Колонии В. anthracis вырастают и трудно снимаются петлей с поверхности агара, в то время как колонии близкородственных сапрофитов снимаются легко. Для идентификации с питательного агара отбирают не менее 10 шероховатых, при отсутствии такого количества - все шероховатые колонии.

Из всех отобранных колоний делают мазки на 2 или более предметных стеклах. Мазки фиксируют и окрашивают двумя способами - по Ребигеру (или по Граму) и сибиреязвенной соматической люминесцентной сывороткой. При просмотре мазков учитывают характерную для сибиреязвенного микроба морфологию (длинные нити, концы палочек обрублены), при окраске люминесцирующими сыворотками - специфическое свечение на 4+ или 3+. Для дальнейшей идентификации отбирают только те колонии, которые состоят из характерных для сибиреяз­венного микроба палочек. При возможности из этих же колоний делают посевы на дифференциально-диагностическую среду или кровяной агар, на МПБ и на косой агар. На чашки с питательным агаром посев производят секторами (6-8 колоний на одну чашку). Посевы помещают в термостат на 18-20 часов, после чего проводят учет и отбор для дальнейшей идентификации по полной схеме лабораторного исследования. Отбирают те колонии, которые при росте на кровяном агаре не дают гемолиза бараньих эритроцитов, формируют характерный «комочек ваты» на дне пробирки при выращивании на МПБ.

Биологическая проба.

Для постановки биологической пробы используют белых беспородных мышей или морских свинок, иногда кроликов породы «шиншила» (для определения вирулентности атипичных сибиреязвенных штаммов). Исследуемый материал, подготовленный для исследования, суспендируется в небольшом объеме 0,9 % раствора хлорида натрия и вводится подкожно во внутреннюю поверхность бедра 2 мышам в объеме 0,2-0,5 мл или 2 морским свинкам в объеме 0,5-1,0 мл. Гибель зараженных животных наступает через 1-3 суток, иногда позже. Павших животных вскрывают, делают мазки-отпечатки из тканей и органов, а также посевы на МПА или агар Хоттингера. Мазки-отпечатки фиксируют в спирте с 3 % перекисью водорода в течение 30 мин, а затем окрашивают раствором Ребигера или метиленовой синькой. В мазках при микроскопии сибиреязвенные бациллы расположены короткими цепочками, попарно или поодиночке, окружены розовой капсулой, зачастую сливающуюся вокруг групп микробов. Для обнаружения капсул окрашивают одним из методов (по Ребигеру, Михину, Романовскому-Гимза). Лучшей краской является раствор Ребигера, который одновременно фиксирует и красит. В краске нефиксированный или фиксированный мазок выдерживают 15-20 секунд, затем промывают водой и высушивают. Нефиксированный окрашенный мазок по Ребигеру нельзя считать полностью обезвреженным, поэтому после просмотра его следует опустить в 6% раствор перекиси водорода. В мазках из свежего патологического материала капсула вокруг микроба окрашивается в розовый или красно-фиолетовый цвет, тело микробной клетки - в темно-фиолетовый.

В посевах при просмотре чашек вырастают крупные шероховатые колонии с бахромчатой периферией. При вскрытии биопробных животных, павших от сибирской язвы, отмечают характерный для сибиреязвенной инфекции студенистый геморрагический отек подкожной клетчатки на месте введения материала, гиперемию внутренних органов, увеличение селезенки и несвернувшуюся кровь.

15.7. Идентификацию выделенной культуры проводят на основании следующих признаков:

для сибиреязвенного микроба характерны следующие морфологические формы: споры, вегетативные палочки и капсульные формы. Во всех случаях при приготовлении мазков обращают внимание на их фиксацию в мазках с добавлением 3 % перекиси водорода и окраску соответствующую форме возбудителя. Универсальной краской является раствор Ребигера, при окраске которым четко видны споры, розовая капсула и синие палочки. При окраске мазков сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками можно увидеть не только характерную морфологию микроба, но и определить специфичность, что существенным образом ускоряет проведение лабораторного анализа;

характерная морфология выросших на питательном агаре коло­ний. При использовании МПА, агара Хоттингера или дифференциаль­но-диагностической среды колонии сибиреязвенного микроба отлича­ются от колоний спорообразующих сапрофитов меньшими размерами, большей шероховатостью и более выраженными локонами по перифе­рии. Следует всегда обращать внимание, как колония берется петлей. Если масса микробов трудно отбирается бактериологической петлей, это свидетельствует в пользу сибиреязвенного микроба;

характер роста на МПБ. Некоторые представители спорообразующих сапрофитов могут расти на бульоне аналогично сибиреязвен­ному микробу. Однако при встряхивании пробирки сапрофиты легко мутят бульон, в то время как сибиреязвенный микроб дает комочек, трудно разбивающийся при встряхивании;

при использовании дифференциально-диагностической среды учитываются одновременно два важных диагностических признака - харак­тер выросших колоний и тест на щелочную фосфатазу;

тест с сибиреязвенным бактериофагом. Сибиреязвенный микроб лизируется сибиреязвенными фагами («Гамма», К и другими). Пробу с фагом ставят следующим образом. Свежеприготовленные чашки с агаром Хоттингера или МПА перед постановкой пробы подсушивают в термостате. Расчерчивают дно чашки снаружи на квадраты со стороной 2 см. Бактериологической петлей или пипеткой на каждый квадрат наносят каплю 5-6-часовой бульонной культуры сибиреязвенного микроба. Чашку с приоткрытой крышкой подсушивают 30 минут в термостате, а затем в центр подсохшей капли наносят петлей каплю цельного сибиреязвенного бактериофага. Результаты учитывают через 5-6 часов инкубации чашек при 370С, просматривая их под малым увеличением микроскопа. В более поздние сроки через 12-24 часа просматривают чашки невооруженным глазом. В случае положительного результата на месте нанесе­ния капли бактериофага наблюдается полный или частичный лизис ко­лоний в виде «бляшек»;

при вскрытии биопробных животных, которым введена исследуе­мая культура, делают мазки из перитониального экссудата и крови сердца и мазки-отпечатки из органов. Мазки фиксируют и окрашивают по Ребигеру или метиленовой синькой. В мазках от животных микробы расположены короткими цепочками, попарно или поодиночке, окруже­ны розовой капсулой. Способность к капсулообразованию in vivo из всех представителей рода Bacillus присуща только возбудителю сибир­ской язвы. Встречающиеся в природе атипичные штаммы, не образующие капсулу, но по другим тестам соответствующие сибиреязвенному микробу, требуют дополнительных исследований;

тест «жемчужного ожерелья». Перед постановкой пробы осту­женный до 45°С 2 % питательный агар разливают по 10 мл в 3 пробир­ки. В первую добавляют пенициллин из расчета 0,5 ед/мл, вторую -0,05 ед/мл, третья - без антибиотика остается контрольной. Содержимое каждой пробирки выливают в чашку Петри. После застывания среды дно чашек снаружи размечают на квадраты или кружки, на которых пишут номера анализа. На обозначенные участки наносят по одной кап­ле изучаемых 3-6-часовых бульонных культур. На одной чашке может быть поставлено до 10 проб. Посевы инкубируют при 37°С. Не позже 3 часов просматривают рост с сухой (х40) и иммерсионной (х90) фазовоконтрастными системами под микроскопом, предварительно накрыв каждый отмеченный участок покровным стеклом. На стекле, содержащем пенициллин, видны шарообразные формы бактериальных клеток, расположенных в виде цепочек, напоминающих ожерелье из жемчуга. Спорообразующие сапрофиты, как правило, устойчивые к пенициллину, образуют на среде с пенициллином обычные формы микробов. В контрольной чашке без пенициллина сибиреязвенный микроб формирует длинные цепи палочек;

тест на подвижность. Сибиреязвенный микроб неподвижен, чем отличается от большинства спорообразующих сапрофитов. Подвижность устанавливают в «висячей капле» или при посеве уколом в полужидкий агар. В полужидком агаре рост сибиреязвенного микроба наблюдается только по ходу укола. Посевы выдерживают в термостате при 37° С 18-20 часов;

гемолиз эритроцитов барана. Для проведения этого теста готовят кровяной агар - МПА или агар Хоттингера с 3-5 % дефибринированной крови барана (рН 7,2-7,3). Выдерживают в термостате при 37°С в течение 18-20 часов, после чего учитывают резуль­тат. В эти сроки сибиреязвенный микроб не дает гемолиза эритроцитов барана в отличие от родственных спорообразующих сапрофитов, обра­зующих широкую зону гемолиза вокруг выросших колоний;

тест на лецитиназу. Наличие или отсутствие лецитиназной активности определяют в жидкой желточной среде или на агаре Хоттин­гера, в который добавлен стерильно желток куриного яйца. В пробирки с 5 мл жидкой желточной среды засевают петлей суточную культуру и инкубируют в термостате при 37°С. Возбудитель сибирской язвы, как правило, в течение нескольких суток инкубирования не свертывает жел­ток, в то время как представители спорообразующих сапрофитов свер­тывают желток уже в первые сутки. На плотной питательной среде с желтком сибиреязвенный микроб растет, не образуя вокруг колоний мутной белой зоны. Вокруг колоний большинства сапрофитов, выраба­тывающих активную лецитиназу, просматривается широкая мутно-белая зон

 

 

 

ПРИЛОЖЕНИЕ № 2



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2017-02-07; просмотров: 241; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 52.91.177.91 (0.013 с.)